Ciências Biomédicas, Biomed Biopharm Res., 2022; 19(2):337-354
doi: 10.19277/bbr.19.2.301; versão pdf aqui [+]; versão inglês html [EN]
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Ablação da atividade da Kex2 aumenta a proteotoxicidade induzida pelo proIAPP na levedura
Sofia Ferreira 1,2, Ana F. Raimundo 3,4,5, Inês Farrim 1,2, Regina Menezes 1,3,4*
1CBIOS - Center for Biosciences & Health Technologies, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, Campo Grande 376, 1749-024 Lisboa, Portugal; 2Universidad de Alcalá, Escuela de Doctorado, Departamento de Ciencias Biomédicas, Madrid, Espanha; 3iBET - Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Apartado 12, 2781-901 Oeiras, Portugal; 4NOVA Medical School | Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa, Portugal; 5ITQB-NOVA, Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier, Universidade NOVA Lisboa, Oeiras, Portugal
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Resumo
A deposição pancreática do Polipéptido Amilóide dos Ilhéus (IAPP) é uma marca histopatológica da diabetes tipo 2. O processamento inadequado de IAPP imaturo pelas proproteínas convertases (PCs) despoleta a acumulação de formas não processadas que favorecem o aumento da formação de agregados nas células β. A Kexina 2 (Kex2) de Saccharomyces cerevisiae é o protótipo da família das PCs eucarióticas. Contudo, até ao momento, não existem evidências da ação da Kex2 no processamento do preproIAPP, em levedura. Neste estudo, pretendemos abordar o possível papel da Kex2 na maturação do IAPP como uma ferramenta para investigar a contribuição do processamento aberrante na proteototoxicidade deste péptido amiloidogénico. Foram utilizados modelos de S. cerevisiae que expressam diferentes fusões quiméricas de IAPP humano e nas quais o gene KEX2 foi geneticamente deletado. Os efeitos citotóxicos da ablação da Kex2 foram avaliados através da análise de curvas de crescimento e ensaios de viabilidade celular por citometria de fluxo. O perfil de bandas do IAPP foi avaliado por ensaios de imunotransferência usando um anticorpo anti-IAPP. Agregados intracelulares de IAPP foram avaliados por microscopia confocal de fluorescência. Os dados mostraram que os mutantes kex2 exibem defeitos de crescimento, potenciados pela expressão do preproIAPP-GFP, proIAPP-GFP e IAPP-GFP, havendo uma citotoxicidade aumentada para o proIAPP-GFP. No entanto, a ausência da Kex2 não parece afetar o padrão da proteína IAPP nem a frequência/distribuição dos seus agregados intracelulares em levedura. Estes resultados sugerem que a Kex2 não é essencial para o processamento do IAPP em levedura, pelo menos nas condições testadas.
Palavras-chave: Amilina, Polipéptido, Amilóide dos Ilhéus (IAPP), Kexina 2, Processamento de pro-hormonas, Saccharomyces cerevisiae
Recebido: 13/11/2022; Aceite: 31/12/2022
Introdução
As doenças de dobramento incorreto de proteínas abrangem um grupo heterogéneo de patologias nas quais um péptido amiloidogénico adquire uma estrutura tridimensional alternativa, oligomeriza e se acumula nos tecidos onde ocorre o dano específico da doença. Esse processo pode ocorrer sistemicamente ou no local da produção da proteína, como é o caso da diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (1). A deposição descontrolada do Polipéptido Amilóide dos Ilhéus (IAPP) é uma característica histopatológica da DM2, estando presente em quase 90% dos indivíduos após a sua morte (2) e em 50% dos insulinomas (3). O IAPP, ou amilina, é uma hormona de 37 aminoácidos que atua na regulação do metabolismo e na homeostasia da glucose. Atua nas células do músculo e no tecido adiposo estimulando a captação de glucose e retardando o esvaziamento gástrico através da sinalização no Sistema Nervoso Central (4). Relativamente à sua síntese, o IAPP é expresso e processado concomitantemente com a insulina nas células β pancreáticas. A forma inicial e imatura do IAPP (preproIAPP, ppIAPP) compreende uma sequência de 89 resíduos de aminoácidos com um péptido sinal. Ao longo do seu transporte para o retículo endoplasmático (RE), o péptido sinal é clivado, originando uma molécula de proIAPP (pIAPP) que é processada no complexo de Golgi tardio através da clivagem das regiões flanqueadoras pelas proteína convertases (PC) 1/3, PC 2 e carboxipeptidase E. Nesta etapa, ocorre também a amidação da extremidade C-terminal e a formação de uma ponte de dissulfeto, o que contribui para a produção de uma hormona de IAPP matura e ativa (5). O IAPP maturo é então armazenado juntamente com a insulina nos grânulos secretórios, sendo libertado após a estimulação da glucose (6,7). No entanto, quando existe uma alta demanda por insulina, as células β são obrigadas a funcionar com alta rotatividade e podem perder a capacidade de processar adequadamente toda a insulina e o IAPP. Consequentemente, formas de IAPP imaturas altamente amiloidogénicas surgem nas ilhas pancreáticas de indivíduos com diabetes (8). Experiências de microscopia imunoeletrónica, em ratinhos transgénicos para IAPP humano, revelaram a presença de agregados fibrilares imunorreativos a soros de pIAPP nos grânulos secretores das células β (8). Além disso, em células onde ambas as PCs não se encontram presentes, observou-se deposição de agregados de proIAPP. Tal evidência não foi documentada em modelos celulares contendo a PC2 e a PC1/3 completamente funcionais (9). Corroborando a relevância do processamento aberrante na acumulação de intermediários de IAPP imaturos e no progresso da doença, níveis alterados de pIAPP/IAPP no soro foram detetados em indivíduos com diabetes do tipo 2 e com um quadro de resposta deficiente ao estímulo de glucose (10). A acumulação de espécies intermediárias de IAPP favorece a formação de oligómeros que podem atuar como agentes desencadeadores da depleção das células β (4). Acredita-se que estes oligómeros de IAPP estejam envolvidos em vários mecanismos tóxicos, nomeadamente na disrupção estrutural da membrana celular (11-12), inibição da proliferação celular, desregulação da homeostasia do cálcio (14) e produção de espécies reativas de oxigénio (4,15-16). Foi relatado que concentrações aumentadas de pIAPP no RE ativam a unfolfed protein response (UPR) e outras vias de stress do RE que, se não forem devidamente controladas, podem culminar na apoptose das células (17-18). Apesar destas evidências, o envolvimento destas formas não processadas nos efeitos citotóxicos atribuídos ao IAPP ainda não é totalmente compreendido.
Recentemente, descrevemos um modelo de Saccharomyces cerevisiae capaz de expressar diferentes formas processadas de IAPP, fundidas à Proteína Verde Fluorescente (GFP) (19). Estes modelos recapitularam as principais vias moleculares relacionadas à agregação do IAPP, representando uma ferramenta robusta para estudar os mecanismos moleculares afetados pela toxicidade deste péptido amiloidogénico. O mesmo estudo mostrou que o preproIAPP-GFP é parcialmente processado até adquirir a sua forma matura, o que implica a ação de uma proteína convertase equivalente à PC 1/3 e PC2 nas células β. Neste sentido, a Kexina 2 (Kex2) aparece como a candidata mais provável para realizar tal processamento. A Kex2 foi descrita como sendo uma protease envolvida no processamento de pro-hormonas, que catalisa a clivagem de péptidos nos motivos Lys-Arg e Arg-Arg, num processo dependente de Ca2+ (20). Seletivamente localizada no compartimento tardio do complexo de Golgi, em levedura, a Kex2 contém um único domínio transmembranar e um sinal de retenção na sequência da sua cauda citosólica C-terminal. De acordo com esta compartimentalização, a Kex2 tem sido descrita como uma protease que atua num espectro estrito de proteínas alvo nos compartimentos tardios da via secretória (por exemplo, precursores de pro-hormonas, neuropéptidos e proteínas integrais de membrana) (21). Apoiando um possível papel da Kex2 no processamento do IAPP, esta convertase demonstrou ser capaz de clivar a proteína precursora da insulina na via secretória tardia (22). Tal dado é particularmente interessante uma vez que o IAPP e a insulina são coprocessados pelas mesmas proteínas convertases nas células β pancreáticas (23).
Embora algumas proteínas tenham sido já descritas como potenciais alvos da Kex2, o número de substratos para os quais existe prova experimental de clivagem por parte desta protease permanece escasso (24). No que diz respeito ao processamento do IAPP, a especificidade do substrato da Kex2 é de extrema importância. A Kex2 de Saccharomyces cerevisiae é o protótipo da família das PCs eucarióticas encontradas em humanos, e que abrange a PC1/3, PC2 e a furina (25). Especificamente, no que diz respeito ao IAPP, nenhuma correlação direta entre a atividade da Kex2 e o processamento deste péptido amiloidogénico foi relatada até o momento. Para preencher esta lacuna de conhecimento, usámos modelos geneticamente modificados de S. cerevisiae capazes de expressar diferentes formas de IAPP humano a fim de investigar o possível envolvimento da Kex2 no processamento enzimático do IAPP. Partilhando mecanismos celulares e moleculares altamente conservados com as células humanas, a levedura representa um modelo experimental versátil para estudar os processos biológicos envolvidos em doenças humanas (26). Desta forma, o estudo da ação proteolítica da Kex2 no IAPP, em modelos de levedura, poderá representar uma ferramenta importante para elucidar os mecanismos subjacentes ao processamento aberrante do IAPP e consequente acumulação de espécies imaturas observada em cenários de doença.
Materiais e métodos
Estirpes de levedura e plasmídeos
A estirpe BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 e a estirpe mutante isogénica kex2 (EUROSCARF) foram usadas neste estudo. Ambas as estirpes foram transformadas com diferentes fusões quiméricas de IAPP ligadas a GFP. Os procedimentos de transformação das leveduras foram realizados conforme indicado no método de acetato de lítio (27). Os plasmídeos usados encontram-se listados na Tabela 1.
Condições de crescimento das culturas de levedura
As células foram mantidas em meio sintético com glucose. Antes de cada experiência, foi preparado um inóculo em meio sintético com rafinose a 30°C, durante 24 h sob agitação orbital. As culturas de células foram diluídas em meio fresco e incubadas tal como acima indicado, até atingir uma densidade ótica a 600 nm (OD600) de 0.5 ± 0.05. As leituras foram adquiridas usando o espectrofotómetro de microplacas Biotek Power Wave XS (Winooski, VT, EUA). A expressão do IAPP foi modulada através da incubação das células em meio sintético com glucose (repressão) ou com galactose (indução). O protocolo detalhado foi anteriormente descrito pelo nosso grupo (19).
Citometria de fluxo
As culturas celulares foram diluídas para uma OD600 igual a 0,1 ± 0,01 em meio sintético com galactose e incubadas a 30°C por 12 h sob agitação orbital. A citometria de fluxo foi realizada usando iodeto de propídio (PI) tal como descrito anteriormente (19).
Extração de Proteínas e Imunotransferência
As culturas celulares foram diluídas para uma OD600 igual a 0,1 ± 0,01 em meio sintético com galactose e incubadas a 30°C por 12 h sob agitação orbital. A extração de proteínas e a imunotransferência foram realizadas tal com anteriormente descrito (19) e usando os anticorpos indicados na Tabela Suplementar S1.
Curvas de crescimento
Para as curvas de crescimento, as culturas foram diluídas para uma OD600 igual 0,05 ± 0,005 em meio sintético com glucose ou galactose, e foram incubadas a 30°C com agitação por 24 h. O crescimento foi monitorizado de hora a hora medindo a OD600 com um espectrofotómetro de microplacas Biotek Power Wave XS.
Microscopia de fluorescência e confocal
As culturas celulares foram diluídas para uma OD600 igual a 0,1 ± 0,01 em meio sintético com galactose e incubadas a 30°C por 12 h sob agitação orbital. As células foram recolhidas por centrifugação a 3000 g por 3 min e ressuspendidas em PBS. As lâminas foram preparadas com 4 μl de suspensão de células e misturadas com 4 μl de agarose de baixo ponto de fusão. A fluorescência do GFP foi visualizada usando um microscópio Carl Zeiss LSM 710 (Jena, Alemanha) para microscopia confocal ou Leica Z2 (Wetzlar, Alemanha) para microscopia de fluorescência. O número de células com agregados foi avaliado através da monitorização de pelo menos 800 células para cada condição. As imagens foram analisadas usando o software Fiji-ImageJ1.51j8 (EUA).
Análise Estatística
O software Graphpad Prism 6 foi usado para fazer a análise estatística dos resultados. A análise ANOVA bilateral com o teste de comparação múltipla de Tukey foi realizada para avaliar as diferenças entre as condições no ensaio de viabilidade celular. A análise ANOVA bilateral com o teste de comparação múltipla de Sidak foi realizada para avaliar as diferenças entre as condições nos ensaios de imunotransferência e microscopia.
Resultados e Discussão
Kex2 como potencial pro-hormona convertase envolvida no processamento do ppIAPP
O IAPP é o principal elemento dos depósitos amilóides encontrados nas ilhas pancreáticas de doentes diabéticos. Tal como a insulina, o IAPP é produzido no RE na forma de uma preprohormona, sendo depois convertido à forma matura nos grânulos de secreção antes da sua libertação extracelular. O IAPP é formado pela remoção das regiões flanqueadoras C- e N-terminais através da ação das prohormona convertases PC2 e PC1/3 que reconhecem sítios de clivagem específicos e altamente conservados na sequência peptídica (5) (Figura 1A). Na S. cerevisiae, a Kex2 (ou kexina) aparece como sendo o homólogo destas enzimas de processamento. A Kex2 cliva os péptidos alvo em sítios dibásicos, sendo a sua ação necessária para produzir as formas finais e ativas das proteínas secretadas, como o caso da toxina killer, o fator alfa, a insulina e, eventualmente, o IAPP (28). A Kex2 é uma proteína membranar que é inicialmente direcionada para o RE e que depois, funciona na rede trans-Golgi (TGN), circulando entre as vesículas trans-Golgi e os compartimentos endossomais tardios (29-30). Estruturalmente, a Kex2 contém um péptido sinal de endereçamento para o RE na extremidade N-terminal, seguido por um domínio catalítico que possui a maioria das semelhanças entre as sequências de aminoácidos da PC2, PC3 e Kex2. Dentro dos primeiros 600 aminoácidos, 34-45% dos resíduos são idênticos entre qualquer par dessas proteínas. Além dos primeiros 600 resíduos, a Kex2 contém ainda uma região rica em serina/treonina hiperglicosilada e um único domínio transmembranar que é importante para a sua função e localização enquanto proteína de membrana integral (Figura 1B) (30-31).
A ausência da protease Kex2 aumenta a citotoxicidade do proIAPP-GFP em levedura
Na diabetes, a necessidade aumentada para a produção de insulina induzida por uma condição de hiperglicemia é acompanhada por uma produção exacerbada de IAPP que sobrecarrega a maquinaria de processamento das células β pancreáticas. Anomalias ao nível do processamento pós-traducional do péptido precursor do IAPP tem sido associado à acumulação de formas imaturas intermediárias de IAPP e consequente formação de oligómeros intracelulares tóxicos (1,4,5).
Para estudar o impacto da ausência da Kex2 no processamento do IAPP, desenvolvemos modelos de levedura geneticamente modificados que não possuem o gene KEX2 (estirpe mutante kex2) e que expressam simultaneamente diferentes construções quiméricas de IAPP humano (p426-ppIAPP-GFP (ppIAPP-GFP), p426 -pIAPP-GFP (pIAPP-GFP) e p426-matIAPP-GFP (matIAPP-GFP)) (19). Nestas construções, os respetivos cDNAs foram clonados em fusão com o GFP e sob a regulação do promotor induzido pela galactose (GAL1). Para comparação, a estirpe isogénica BY4741 foi usada como controlo, uma vez que possui uma maquinaria de processamento totalmente funcional. Estes modelos foram previamente descritos e caracterizados, tendo mostrado que a expressão e agregação de espécies imaturas de ppIAPP causam uma marcada toxicidade celular (19). A expressão de fusões quiméricas de IAPP no mutante nulo foi confirmada pela presença de células que expressam GFP conforme verificado por citometria de fluxo (Figura Suplementar S1). Posteriormente, a viabilidade celular foi avaliada após 12 h de indução da expressão de IAPP com galactose, através de marcação com iodeto de propídio (PI) seguida de citometria de fluxo. Em condições normais, o PI não tem capacidade de penetrar a membrana celular, sendo excluído das células viáveis. Este composto apenas consegue atravessar membranas celulares comprometidas, sendo, portanto, considerado um indicador da integridade membranar (33). De modo consistente com dados anteriormente obtidos pelo nosso grupo, às 12 h de indução, apenas a expressão do ppIAPP-GFP reduziu significativamente a viabilidade celular em células BY4741, com as outras construções mostrando níveis de toxicidade mais baixos (19). Curiosamente, a ablação genética do gene KEX2 aumentou significativamente a citotoxicidade do pIAPP-GFP, enquanto nenhum efeito foi observado nas estirpes que expressam as restantes fusões. Em células mutantes que expressam o ppIAPP, os níveis de PI permaneceram inalterados, sugerindo que a ausência da protease Kex2, por si só, não é suficiente para exacerbar ainda mais a toxicidade da forma imatura do IAPP (Figura 2). Uma explicação plausível para este resultado relaciona-se com o facto do endereçamento do ppIAPP-GFP para o RE (mediado pelo péptido sinal) poder exacerbar a acumulação das formas imaturas de IAPP e, assim, obstruir a via secretória, criando um problema a montante da clivagem por ação das convertases.
A membrana celular da levedura é conhecida por estar envolvida nos principais processos biológicos, nomeadamente, serve como uma barreira para a difusão de solutos, armazena energia na forma de iões transmembranares e gradientes de soluto, fornece locais de vias enzimáticas envolvidas na síntese de componentes celulares, entre outros. Essas funções são cruciais para manter a homeostasia intracelular e reunir os elementos necessários para o crescimento e divisão celular (34). Uma vez que, em certas condições, a análise do PI mostrou alterações na integridade da membrana (Figura 2), decidimos avaliar de que forma a expressão de diferentes construções de IAPP poderia interferir no crescimento do mutante nulo. Para isso, foram analisadas as curvas de crescimento das estirpes wild type e mutante (Figura 3A). As culturas de BY4741 que expressam as três formas de IAPP exibiram um período de latência inicial compatível com a mudança da fonte de carbono de rafinose para galactose. Posteriormente, essas estirpes retomaram o seu crescimento e comportaram-se de maneira semelhante, à exceção das células que expressam o ppIAPP-GFP que cresceram mais lentamente do que as células controlo após 12 h de indução com galactose. No que respeita à comparação entre as curvas de crescimento das estirpes wild type e mutante, observou-se uma diferença acentuada, com as culturas de kex2 a apresentar menores valores de biomassa final. Em condições semelhantes, a cultura controlo da BY4741 atingiu uma densidade ótica de 0,43 ± 0,013 após 24 h de indução com galactose, enquanto a cultura controlo da kex2 atingiu valores de 0,35 ± 0,008 no mesmo tempo de incubação (Figura 3A). A monitorização do crescimento da cultura kex2 também mostrou uma área sob a curva (AUC) reduzida, quando comparada às células BY4741, suportando a ocorrência de defeitos no crescimento na estirpe mutante (Figura 3B). Estes resultados vão ao encontro de estudos sistemáticos publicados que mostram que o mutante kex2 cresce a taxas mais lentas em comparação com a estirpe wild type (35). A análise da AUC também revelou que a ausência da Kex2 potencia o comprometimento do crescimento mediado pela expressão do ppIAPP-GFP, pIAPP-GFP e matIAPP-GFP, conforme concluído pelo aumento de ΔAUC calculado como a diferença entre a AUC do controlo e a AUC do respetiva fusão de IAPP (Figura 3C). Estes resultados foram corroborados pelos ensaios fenotípicos que mostraram que a citotoxicidade em todas as estirpes, em particular as que expressam ppIAPP-GFP e pIAPP-GFP, foi aumentada no mutante kex2 (Figura 4).
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O processamento do IAPP e a sua distribuição intracelular não são afetados em mutantes kex2
Estudos de microscopia eletrónica de transmissão de depósitos amilóides no pâncreas de ratinhos transgénicos para IAPP humano identificaram a presença fibrilas intragranulares contendo moléculas de pIAPP. As fibrilas presentes neste local foram associadas ao comprometimento do processamento de pro-hormonas e consequente acumulação de pIAPP (8). Em células β contendo uma maquinaria de processamento funcional, a expressão de pIAPP não resultou na formação de depósitos amilóides. Pelo contrário, a expressão de pIAPP em células GHC4 que não possuem as convertases PC2 e PC1/3 resultou na formação amilóide de pIAPP (36). Estes resultados apontaram o processamento anormal como um fator chave para a acumulação de intermediários amiloidogénicos de pIAPP. Para verificar se o aumento da citotoxicidade do pIAPP em mutantes kex2 estava associado à acumulação de espécies de IAPP não processadas, realizámos ensaios de imunotransferência. Conforme ilustrado na Figura 5, não foram observadas diferenças visíveis no perfil de IAPP entre as duas estirpes. Em ambos os casos, os lisados de proteína total de células que expressam o ppIAPP-GFP revelaram a presença de um sinal de 38 kDa compatível com o peso molecular da fusão ppIAPP-GFP. Um sinal adicional específico de IAPP de ~32 kDa também foi detetado nessas amostras (Figura 5). De forma semelhante, os lisados de proteína de pIAPP-GFP revelaram a presença de um sinal de 36 kDa, correspondente ao peso molecular da fusão pIAPP-GFP. Dois outros sinais de ~32 e ~70 kDa foram também identificados. Tais sinais poderão representar intermediários de processamento (sinais de ~ 32 kDa) e dímeros (sinal de ~ 70 kDa) de espécies de IAPP. Lisados de proteína total de células que expressam matIAPP-GFP revelaram a existência de um único sinal de ~31 kDa que corresponde ao peso molecular da construção madura. Resultados semelhantes foram observados quando as membranas foram incubadas com o anticorpo anti-GFP (Figura Suplementar S2). Além disso, não foram encontradas diferenças significativas nos níveis totais de IAPP entre a estirpe wild type e a mutante. Em ambas as estirpes, as células que expressam o pIAPP-GFP apresentaram níveis mais elevados de IAPP total (Figura 5), porém sem impacto significativo no número de células positivas para GFP, conforme revelado pela análise de citometria de fluxo (Figura Suplementar S1). Técnicas mais robustas, como cromatografia de exclusão por peso molecular, deverão ser úteis para elucidar essa questão.
Em seguida, foi avaliado por microscopia confocal se a ausência da Kex2 interferia com a distribuição subcelular das proteínas quiméricas. À primeira vista, pode-se observar que as células kex2 são maiores que as células wild type, fenómeno já relatado na literatura. Além da S. cerevisiae, um espetro variado de descrições fenotípicas foi relatado para uma variedade de mutantes de deleção kex2 de outras leveduras. As características fenotípicas descritas para esses mutantes incluem alterações morfológicas que se acredita serem derivadas da atividade deficiente das enzimas modificadoras da parede celular (24).
Em relação à agregação de proteínas, conforme observado nas células BY4741, as células kex2 que expressam o ppIAPP exibiram uma distribuição heterogénea de inclusões intracelulares bem definidas (Figura 6, A e B), enquanto um sinal de GFP mais difuso foi observado nas células kex2 expressando pIAPP-GFP ou matIAPP-GFP. Notavelmente, nestas células, foram detetados agregados menos definidos num compartimento não fluorescente, presumivelmente o vacúolo, indicando a acumulação de agregados intravacuolares. Tal evidência poderá representar um mecanismo de defesa celular que envolve a compartimentalização de proteínas tóxicas. Experiências adicionais serão necessárias para elucidar esta questão. Embora a inspeção visual sugira que os agregados nas células que expressam ppIAPP-GFP parecem ser maiores e mais frequentes no mutante kex2 (Figura 6, A e B), a contagem sistemática do número de células contendo inclusões proteicas de IAPP usando o software ImageJ não indicou diferenças entre as duas estirpes (Figura 6C).
Com base nestes dados, os nossos resultados não suportam a ideia de que o IAPP poderá ser um alvo para o processamento mediado pela Kex2, pelo menos nas condições testadas. Os fenótipos dos mutantes kex2 podem ser atribuídos a falhas no processamento de substratos importantes, tornando-os disfuncionais, e consequentemente afetando o crescimento celular. Um exemplo disso, é o caso da α-feromona, em que a falha do seu processamento mediado pela Kex2 torna o mutante incapaz para efetuar o acasalamento (37). Não obstante, o aumento acentuado na permeabilidade celular mostrado pelo mutante kex2 que expressa o pIAPP-GFP revela algum grau de especificidade de resposta que necessita de investigação adicional.
No nosso estudo, a ausência da Kex2 não parece resultar no comprometimento da clivagem e na acumulação de formas não processadas de pIAPP-GFP. A localização restrita da Kex2 na rede trans-Golgi tardia e nos compartimentos pré-vacuolares explica o seu limitado espectro a proteínas alvo ligadas à superfície celular ou envolvidas na via secretória (24). Consequentemente, os fenótipos dos mutantes kex2 têm sido caracterizados pela secreção de proteínas precursoras não processadas para o ambiente extracelular, como é o exemplo da xilanase secretora de T. reesei (38). No entanto, evidências demonstraram que esses efeitos não são claros, uma vez que os fenótipos observados nos mutantes kex2 podem ser devidos apenas à ocorrência de efeitos secundários à mutação. Além disso, a falha no processamento mediado pela Kex2 pode ser mascarada pela atividade de outras proteases, como o caso das yapsinas, uma família de proteases aspárticas ancoradas por glicosilfosfatidilinositol (GPI) (24,39). Mais estudos serão necessários para entender melhor o papel das enzimas envolvidas no processamento de formas imaturas do IAPP em leveduras.
Conclusões
Os fenótipos dos mutantes kex2 têm sido caracterizados pela secreção de precursores de proteínas não processados para o espaço extracelular. Embora existam algumas proteínas que têm vindo a ser indicadas como possíveis substratos para a Kex2, o número de proteínas para as quais existe uma prova experimental de clivagem mediada por esta protease permanece baixo. No que diz respeito ao IAPP, não há evidências relatadas sobre os efeitos da Kex2 sobre este péptido. Através da geração de um modelo de S. cerevisiae que não possui o gene KEX2 e que expressa diferentes construções quiméricas, o nosso estudo forneceu novos dados sobre a potencial atividade enzimática desta protease no processamento do IAPP. A ausência da Kex2 reduziu a viabilidade celular das células que expressam o pIAPP, sem afetar o processamento do IAPP e a sua distribuição intracelular. Estes dados colocam em questão a hipótese inicialmente estabelecida de que o IAPP seria um potencial substrato para atividade da Kex2. Estudos adicionais serão necessários para entender melhor os mecanismos que se encontram por detrás do aumento da toxicidade induzida pela expressão do pIAPP no mutante kex2. Além disso, conhecer os substratos da protease Kex2 não só ajudará a explicar os fenótipos observados nos mutantes de deleção, como também fornecerá informações úteis sobre os mecanismos de regulação celular.
Declaração de contribuições dos autores
RM concebeu e projetou os experiências. SF, AFR e IF realizaram as experiências. SF, AFR e RM analisaram os dados e redigiram o artigo. Todos os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versã submetida.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência e do Ensino Superior, e pelas bolsas PTDC/BIA-MOL/31104/2017 (RM) e UIDB/04567/2020 e UIDP/ 04567/2020 (CBIOS). Os autores gostariam de agradecer à FCT pelo apoio financeiro da AFR (PD/BD/135504/2018), SF (UI/BD/151421/2021) e RM (CEEC/04567/CBIOS/2020).
Conflito de interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Referências
1. Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., & Soto, C. (2015). Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine, 21(7), 439–449. doi: 10.1016/j.molmed.2015.04.005.
2. Westermark, P. (1972). Quantitative studies of amyloid in the islets of langerhans. Upsala Journal of Medical Sciences. 77(2), 91-4. doi: 10.1517/03009734000000014.
3. Higham, C. E., Hull, R. L., Lawrie, L., Shennan, K. I. J., Morris, J. F., Birch, N. P., Docherty, K., & Clark, A. (2000). Processing of synthetic pro-islet amyloid polypeptide (proIAPP) ‘amylin’ by recombinant prohormone convertase enzymes, PC2 and PC3, in vitro. European Journal of Biochemistry, 267(16), 4998–5004. doi: 10.1046/j.1432-1327.2000.01548.x.
4. Raimundo, A. F., Ferreira, S., Martins, I. C., & Menezes, R. (2020). Islet Amyloid Polypeptide: A Partner in Crime With Aβ in the Pathology of Alzheimer’s Disease. Frontiers in Molecular Neuroscience, 13, 35. doi: 10.3389/fnmol.2020.00035.
5. Westermark, P., Andersson, A., & Westermark, G. T. (2011). Islet amyloid polypeptide, islet amyloid, and diabetes mellitus. Physiological Reviews, 91(3), 795–826. doi: 10.1152/physrev.00042.2009.
6. Kahn, S. E., Verchere, C. B., D’Alessio, D. A., Cook, D. L., & Fujimoto, W. Y. (1993). Evidence for selective release of rodent islet amyloid polypeptide through the constitutive secretory pathway. Diabetologia, 36(6), 570–573. doi: 10.1007/BF02743276.
7. Zhang, X.-X., Pan, Y.-H., Huang, Y.-M., & Zhao, H.-L. (2016). Neuroendocrine hormone amylin in diabetes. World Journal of Diabetes, 7(9), 189–197. doi: 10.4239/wjd.v7.i9.189.
8. Paulsson, J. F., Andersson, A., Westermark, P., & Westermark, G. T. (2006). Intracellular amyloid-like deposits contain unprocessed pro-islet amyloid polypeptide (proIAPP) in beta cells of transgenic mice overexpressing the gene for human IAPP and transplanted human islets. Diabetologia, 49(6), 1237-46. doi: 10.1007/s00125-006-0206-7.
9. Marzban, L., Trigo-Gonzalez, G., Zhu, X., Rhodes, C. J., Halban, P. A., Steiner, D. F., & Verchere, C. B. (2004). Role of beta-cell prohormone convertase (PC)1/3 in processing of pro-islet amyloid polypeptide. Diabetes, 53(1), 141–148. doi: 10.2337/diabetes.53.1.141.
10. Zheng, X., Ren, W., Zhang, S., Liu, J., Li, S., Li, J., Yang, P., He, J., Su, S., & Li, P. (2010). Serum levels of proamylin and amylin in normal subjects and patients with impaired glucose regulation and type 2 diabetes mellitus. Acta Diabetologica, 47(3), 265–270. doi: 10.1007/s00592-010-0201-9.\
11. Asthana, S., Mallick, B., Alexandrescu, A. T., & Jha, S. (2018). IAPP in type II diabetes: Basic research on structure, molecular interactions, and disease mechanisms suggests potential intervention strategies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 1860(9), 1765–1782. doi: 10.1016/j.bbamem.2018.02.020.
12. Anguiano, M., Nowak, R. J., & Lansbury, P. T. J. (2002). Protofibrillar islet amyloid polypeptide permeabilizes synthetic vesicles by a pore-like mechanism that may be relevant to type II diabetes. Biochemistry, 41(38), 11338–11343. doi: 10.1021/bi020314u.
13. Kim, J., Park, K., Kim, M. J., Lim, H., Kim, K. H., Kim, S.-W., Lee, E.-S., Kim, H. (Henry), Kim, S. J., Hur, K. Y., Kim, J. H., Ahn, J. H., Yoon, K.-H., Kim, J.-W., & Lee, M.-S. (2021). An autophagy enhancer ameliorates diabetes of human IAPP-transgenic mice through clearance of amyloidogenic oligomer. Nature Communications, 12(1), 183. doi: 10.1038/s41467-020-20454-z.
14. Huang, C., Gurlo, T., Haataja, L., Costes, S., Daval, M., Ryazantsev, S., Wu, X., Butler, A. E., & Butler, P. C. (2010). Calcium-activated calpain-2 is a mediator of beta cell dysfunction and apoptosis in type 2 diabetes. The Journal of Biological Chemistry, 285(1), 339–348. doi: 10.1074/jbc.M109.024190.
15. Abedini, A., & Schmidt, A. M. (2013). Mechanisms of islet amyloidosis toxicity in type 2 diabetes. FEBS Letters, 587(8), 1119–1127. doi: 10.1016/j.febslet.2013.01.017.
16. Raimundo, A. F., Ferreira, S., Pobre, V., Lopes-da-Silva, M., Brito, J. A., Dos Santos, D. J. V. A., Saraiva, N., Dos Santos, C. N., & Menezes, R. (2022). Urolithin B: Two-way attack on IAPP proteotoxicity with implications for diabetes. Frontiers in Endocrinology, 13, 1008418. doi: 10.3389/fendo.2022.1008418.
17. Raleigh, D., Zhang, X., Hastoy, B., & Clark, A. (2017). The beta-cell assassin: IAPP cytotoxicity. Journal of Molecular Endocrinology, 59(3), R121–R140. doi: 10.1530/JME-17-0105.
18. Chen, J. J., Genereux, J. C., & Wiseman, R. L. (2015). Endoplasmic reticulum quality control and systemic amyloid disease: impacting protein stability from the inside out. IUBMB Life, 67, 404–413. doi: 10.1002/iub.1386.
19. Raimundo, A. F., Ferreira, S., Farrim, M. I., Santos, C. N., & Menezes, R. (2020). Heterologous Expression of Immature Forms of Human Islet Amyloid Polypeptide in Yeast Triggers Intracellular Aggregation and Cytotoxicity. Frontiers in Microbiology, 11, 2035. doi: 10.3389/fmicb.2020.02035.
20. Fuller, R. S., Brake, A., & Thorner, J. (1989). Yeast prohormone processing enzyme (KEX2 gene product) is a Ca2+-dependent serine protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86(5), 1434–1438. doi: 10.1073/pnas.86.5.1434.
21. Brenner, C., Bevan, A., & Fuller, R. S. B. T.-M. in E. (1994). Biochemical and genetic methods for analyzing specificity and activity of a precursor-processing enzyme: Yeast Kex2 protease, kexin. Proteolytic Enzymes: Serine and Cysteine Peptidases 244, 152–167. doi: 10.1016/0076-6879(94)44013-1.
22. Kjeldsen, T. (2000). Yeast secretory expression of insulin precursors. Applied Microbiology and Biotechnology, 54(3), 277–286. doi: 10.1007/s002530000402.
23. Yonemoto, I. T., Kroon, G. J. A., Dyson, H. J., Balch, W. E., & Kelly, J. W. (2008). Amylin proprotein processing generates progressively more amyloidogenic peptides that initially sample the helical state. Biochemistry, 47(37), 9900–9910. doi: 10.1021/bi800828u.
24. Bader, O., Krauke, Y., & Hube, B. (2008). Processing of predicted substrates of fungal Kex2 proteinases from Candida albicans, C. glabrata, Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris. BMC Microbiology, 8(1), 116. doi: 10.1186/1471-2180-8-116.
25. Rockwell, N. C., & Fuller, R. S. (2002). Specific modulation of Kex2/furin family proteases by potassium. The Journal of Biological Chemistry, 277(20), 17531–17537. doi: 10.1074/jbc.M111909200.
26. Tenreiro, S., & Outeiro, T. F. (2010). Simple is good: yeast models of neurodegeneration. FEMS Yeast Research, 10(8), 970–979. doi: 10.1111/j.1567-1364.2010.00649.x.
27. Gietz, R. D., & Schiestl, R. H. (1991). Applications of high efficiency lithium acetate transformation of intact yeast cells using single-stranded nucleic acids as carrier. Yeast, 7(3), 253–263. doi: doi.org/10.1002/yea.320070307.
28. Fuller, RS., Sterne, R.E., & Thorner, J. (1988). Enzymes required for yeast prohormone processing. Annual Review of Physiology, 50, 345–362. doi: 10.1146/annurev.ph.50.030188.002021.
29. Bryant, N.J., & Stevens, T.H. (1997). Two separate signals act independently to localize a yeast late Golgi membrane protein through a combination of retrieval and retention. The Journal of Cell Biology, 136(2), 287–297. doi: 10.1083/jcb.136.2.287.
30. Wilcox, C.A., & Fuller, R.S. (1991). Posttranslational processing of the prohormone-cleaving Kex2 protease in the Saccharomyces cerevisiae secretory pathway. The Journal of Cell Biology, 115(2), 297–307. doi: 10.1083/jcb.115.2.297.
31. Smeekens, S. P., Chan, S. J., & Steiner, D. F. (1992). The biosynthesis and processing of neuroendocrine peptides: identification of proprotein convertases involved in intravesicular processing. The Peptidergic Neuron, 92, 235–246. doi: 10.1016/S0079-6123(08)61179-6.
32. Seidah, N., & Prat, A. (2012). The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases. Nature Reviews. Drug Discovery, 11, 367–383. doi: 10.1038/nrd3699.
33. Rosenberg, M., Azevedo, N. F., & Ivask, A. (2019). Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports, 9(1), 6483. doi: 10.1038/s41598-019-42906-3.
34. Stewart, G. G. (2017). The Structure and Function of the Yeast Cell Wall, Plasma Membrane and Periplasm. Brewing and Distilling Yeasts, ed. G.G. Stewart (Charm: Springer), 55-75. doi: 10.1007/978-3-319-69126-8_5.
35. Marek, A., & Korona, R. (2013). Restricted pleiotropy facilitates mutational erosion of major life-history traits. Evolution; International Journal of Organic Evolution, 67(11), 3077–3086. doi: 10.1111/evo.12196.
36. Paulsson, J. F., & Westermark, G. T. (2005). Aberrant processing of human proislet amyloid polypeptide results in increased amyloid formation. Diabetes. 54(7), 2117-25. doi: 10.2337/diabetes.54.7.2117.
37. Julius, D., Brake, A., Blair, L., Kunisawa, R., & Thorner, J. (1984). Isolation of the putative structural gene for the lysine-arginine-cleaving endopeptidase required for processing of yeast prepro-alpha-factor. Cell, 37(3), 1075–1089. doi: 10.1016/0092-8674(84)90442-2.
38. Goller, S. P., Schoisswohl, D., Baron, M., Parriche, M., & Kubicek, C. P. (1998). Role of endoproteolytic dibasic proprotein processing in maturation of secretory proteins in Trichoderma reesei. Applied and Environmental Microbiology, 64(9), 3202–3208. doi: 10.1128/AEM.64.9.3202-3208.1998.
39. Komano, H., Rockwell, N., Wang, G. T., Krafft, G. A., & Fuller, R. S. (1999). Purification and characterization of the yeast glycosylphosphatidylinositol-anchored, monobasic-specific aspartyl protease yapsin 2 (Mkc7p). The Journal of Biological Chemistry, 274(34), 24431–24437. doi: 10.1074/jbc.274.34.24431.