10.19277/bbr.19.1.288.pt

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Ciências Biofarmacêuticas, Biomed Biopharm Res., 2022; 19(1):181-194

doi: 10.19277/bbr.19.1.288; PDF version aqui [+] English version html [EN]  

 

Capacidade antioxidante in vitro e efeito hepatoprotetor in vivo do extrato de folhas de Allophylus edulis

Antonia K. Galeano 1, Juan R. Centurión 1, María S. Soverina 1, Laura G. Mereles 2, Miguel A. Campuzano-Bublitz 1, María L. Kennedy 1*

Departamento de Farmacología, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Asunción. Campus UNA, 2169, San Lorenzo, Paraguay; Departamento de Bioquímica de Alimentos, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Asunción. Campus UNA, 2169, San Lorenzo, Paraguay

* autora para correspondência: Este endereço de email está protegido contra piratas. Necessita ativar o JavaScript para o visualizar.

 

Resumo

Allophylus edulis é usado na medicina tradicional, principalmente em doenças do fígado, como hepatite, cancro e cirrose hepática. A atividade hepatoprotetora in vitro foi previamente demonstrada. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade antioxidante e o efeito hepatoprotetor do extrato etanólico de A. edulis em murganhos. Para tal, foi determinada a toxicidade aguda do extrato, avaliando o comportamento geral e, posteriormente, verificando o efeito sobre a hepatite tóxica induzida por paracetamol em murganhos macho. O perfil fitoquímico foi definido, e quantificado o teor de fenóis totais e a sua capacidade antioxidante total através do método do catião radical 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfónico (ABTS). O extrato de folhas de A. edulis não demonstrou efeitos adversos até 2000 mg/kg, p.o. Foram detetados antraquinonas, flavonoides, triterpenoides e taninos. Um elevado teor de compostos fenólicos totais (TPC) foi relacionado com uma elevada capacidade antioxidante. Relativamente, aos resultados dos testes biológicos, A. edulis não afetou o comportamento geral em murganhos, e todas as doses testadas diminuíram a atividade da transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) e da transaminase glutâmico-pirúvica (TGP), os principais marcadores das enzimas hepáticas de dano hepatocelular. Conclui-se que A. edulis possui atividade hepatoprotetora, o que pode estar relacionado com a sua atividade antioxidante.

 

Palavras-chave: Allophylus edulis; hepatoprotetor; paracetamol; marcadores de enzimas hepáticas; capacidade antioxidant

Recebido: 26/04/2022; Aceite: 06/07/2022

Introdução

O fígado é essencial para o metabolismo de praticamente todas as substâncias que nos são estranhas (1). Além disso, sintetiza proteínas plasmáticas, ácidos gordos e é responsável pelo metabolismo dos hidratos de carbono. Também armazena vitaminas lipossolúveis, metais, como ferro e cobre. Este é o órgão que nos desintoxica de fármacos e doutros tipos de produtos químicos não hidrossolúveis, por meio de enzimas hepáticas que são responsáveis pela sua oxidação, redução, hidrolisação ou desmetilação. Finalmente, as células de Kupffer são responsáveis pela capacidade imunológica do fígado (2).

A hepatite é uma inflamação do fígado causada por uma variedade de vírus infeciosos e agentes não infeciosos que levam a vários problemas de saúde, alguns dos quais podem ser fatais. A hepatite viral é a causa mais comum de cirrose hepática, cancro de fígado e mortes relacionadas à hepatite viral (3). O aparecimento dum processo patológico como a hepatite resulta num problema de saúde pública, pois geralmente é assintomático, ou seja, os sintomas aparecem num estágio avançado da doença. Segundo a OMS (organização mundial de saúde), grande parte dos afetados não possui recursos suficientes para suportar os custos de diagnóstico e tratamento, favorecendo o avanço dessa doença silenciosa, o que explica sua alta taxa de morbimortalidade nos mesmos (4) .

A infusão das folhas de Allophylus edulis é utilizada popularmente no Paraguai para tratar doenças do fígado (hepatite, cancro de fígado, cirrose), como estimulante das vias biliares, na inflamação da garganta, em problemas intestinais, como antidiabéticos e como colagogo. As folhas cozidas são usadas para lavar feridas e tratar a hipertensão arterial (5,6). Em relação às atividades biológicas, foi relatada a atividade hepatoprotetora in vitro das folhas de A. edulis var gracilis testadas em cultivo primário de hepatócitos danificados pelo tetracloreto de carbono (CCl4) e galactosamina, e foi confirmado que as C-glicosil flavonas presentes nas folhas têm um papel importante na atividade hepatoprotetora da planta (7). Além disso, foram relatadas capacidade de inibição da enzima conversora de angiotensina (8), atividade antiulcerogénica (9), atividade genotóxica (10), atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e repelente de insetos (11,12).

O presente trabalho centra-se na avaliação da atividade hepatoprotetora de Allophylus edulis em murganhos e da atividade antioxidante do extrato, identificando os principais metabólitos secundários.

Materiais e Métodos

Material vegetal e extração

Folhas de Allophylus edulis Radlk. (St Hil. Jusset Camb.) syn. Allophylus guaraniticus (StHil.Juss et Camb.) conhecido como Cocú (Sapindaceae) foram coletadas de J.A. Saldívar, Central, Paraguai (25º26´50,4¨S e 57º 27´07,1W). O material foi identificado por investigadores do Departamento de Botânica, sendo arquivada uma amostra da espécie botânica no Herbário FCQ (G Delmás 284). Duzentos gramas de folhas secas e em pó foram extraídas com etanol (1:5), primeiro por ultrassom (3X/dia, 15 minutos cada, 3 dias, 30 ºC). O material extraído foi separado e o material residual foi novamente extraído com etanol por refluxo (15 minutos, 3X, 1 L cada). O extrato resultante (34 %) foi mantido no exsicador após a evaporação do solvente, e no dia de cada análise experimental foi dissolvido em etanol/propilenoglicol/água destilada (0,5:4:5,5) antes da administração oral em murganhos.

Reagentes e equipamentos

O álcool etílico absoluto 99,5% foi comprado à CICARELLI Laboratorios (San Lorenzo, Santa Fé, Argentina). TROLOX (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico), ácido gálico mono-hidratado, acetaminofeno e silimarina foram comprados à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O 2,2, azinobis-(3-ethylbenzothiazoline)-6 catião ácido sulfónico radical (ABTS) foi comprado à AppliChem GmbH (Darmstadt, Alemanha), gentamicina à LASCA (San Lorenzo, Paraguay), e pentobarbital de sódio (Nembutal) à Abbott (Tóquio, Japão). Persulfato de amónio, propilenglicol e etanol foram adquiridos localmente. Os kits para a estimativa de fosfatase alcalina (ALP), aspartato aminotransferase (AST o GOT), alanina aminotransferase (ALT o GPT) foram adquiridos à HUMAN Diagnostics Worldwide (Wiesbaden, Alemanha). As medições foram feitas num analisador semi-automático Biosystem BTS 350 UV-Vis spectrophotometer (Shimadzu, Kyoto, Japão).

Análise fitoquímica preliminar

A análise fitoquímica do extrato etanólico de A. edulis foi realizada de acordo com a metodologia descrita (13), baseada na cor tipicamente desenvolvida pelos principais grupos químicos. Resumidamente, as antraquinonas foram detetadas com solução de amónia após extração com solvente orgânico. O flavonoide foi analisado quando uma cor amarela apareceu, aquando da dissolução da amostra numa solução de NaOH. A reação de Liebermann-Burchard foi feita para identificar triterpenoides. A presença de tanino foi observada após a reação com cloreto férrico.

Teor de fenólicos totais e teste de inibição do radical ABTS

A determinação do teor de fenólicos totais no extrato foi precedida por uma extração assistida por ultrassom de fenóis com metanol:água (60:40) e, posteriormente, acetona:água (70:30) seguindo a metodologia descrita (14). Os compostos fenólicos totais (TPC) foram medidos espectrofotometricamente com o método de Folin-Ciocalteu (16). O complexo de cor azul foi quantificado a 765 nm. Uma curva de calibração de ácido gálico foi usada (5-150 µg/mL) e a água destilada foi usada como controlo. A análise foi realizada em triplicado e o teor de fenólicos totais foi expresso em mg de equivalentes de ácido gálico por 100 g de amostra.

A determinação da atividade antioxidante do extrato de A. edulis foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Re. et al 1999 (16). Isto é, foi medida baseada na descoloração do radical catiónico ABTS•+ obtido após a reação de 7 mM ABTS com 2,45 mM persulfato de potássio, incubado 20 horas à temperatura ambiente no escuro. No dia da medição, foi diluído com etanol absoluto para atingir absorvância de 0,7 ± 0,02 a 730 nm. A quantificação de CAT (atividade antioxidante total) foi realizada conforme descrito anteriormente pelo método de regressão linear. As soluções TROLOX (0-320 μM) foram usadas como padrão. Os resultados foram expressos como equivalentes de Trolox µM (TEAC)/g amostra e a capacidade antioxidante foi expressa em µM de TEAC/g por grama de extrato (17). Além disso, a concentração inibitória efetiva (IC50) foi determinada e subsequentemente expressa como % de inibição (%I) da amostra, que foi calculada de acordo com a seguinte equação: %I = (controlo de abs-amostra de abs/controlo de abs) x 100 (abs controlo: absorvância do solvente; amostra de abs: absorvância da solução do extrato). As medições foram feitas em triplicado.

Experimentação animal

Foram utilizados murganhos albinos suíços, machos e fêmeas, pesando 25-35 g. Os animais foram alojados em gaiolas plásticas em temperatura ambiente constante (23-25 °C), com ciclo luz-escuro de 12:12 h, em ambiente com humidade controlada (50-60 %). Foram alimentados diariamente com ração animal padrão (7 g/dia cada) e água ad libitum. Todos os ensaios foram conduzidos de acordo com as normas internacionais de bem-estar animal e o protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Bioética da Faculdade de Ciências Químicas (CEI 469/19). Cada animal foi usado uma vez. O número de animais utilizado e a duração da observação foram os mínimos necessários para obter dados consistentes (18).

Teste de toxicidade oral aguda e avaliação do comportamento geral (teste de Irwin)

O teste de toxicidade aguda foi realizado, de acordo com as diretrizes do Teste nº 420 da Organização para Cooperação e Desenvolvimento Económico (19). Foi realizado em murganhos fêmeas, com doses fixas de 5, 50, 300 e 2000 mg/kg, por via oral. Foi utilizado o teste comportamental (teste de Irwin) que consiste num procedimento observacional para avaliar os efeitos primários de um fármaco ou candidato a fármaco sobre o comportamento e funções fisiológicas do Sistema Nervoso Central, de murganhos machos (20, 21). Os diferentes grupos receberam o extrato etanólico de A. edulis nas doses de 50, 100, 200 e 400 mg/kg, por via oral.

Hepatotoxicidade induzida por paracetamol e tratamento

Murganhos machos albinos suíços em jejum de seis horas foram divididos aleatoriamente em sete grupos (n=8) e tratados por 4 dias conforme segue: grupo veículo (V; 2,5% etanol: 40% propilenoglicol: 57,5% água, p.o.); grupo paracetamol (APAP; água); grupo silimarina (SM; 150 mg/kg de silimarina, p.o.); grupos Ae50, Ae100, Ae200, Ae 400 (tratados com 50; 100, 200 e 400 mg/Kg de extrato de A. edulis, respectivamente, p.o.). A hepatotoxicidade aguda foi induzida no quarto dia usando paracetamol (APAP, 300 mg/kg, i.p.). Duas horas após o tratamento oral, todos os animais, exceto os do grupo veículo, foram induzidos (22). Três horas após a administração de APAP, a amostra de sangue foi coletada por punção cardíaca após anestesia com pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.). Foram determinados TGO, TGP e ALP séricos.

Parâmetros bioquímicos

As transaminase glutâmico-oxalacética (TGO), transaminase glutâmico-pirúvica (TGP) e fosfatase alcalina (ALP) foram determinadas a partir do soro. Para obtenção do soro sanguíneo, as amostras de sangue fresco foram incubadas em banho-maria a 37 °C por 20 minutos e depois submetidas à centrifugação por 15 minutos a 3000 rpm. As amostras foram processadas imediatamente após serem obtidas. O soro controlo (Humatrol normal e patológico) foi processado antes de cada determinação, como controlo de qualidade interno, e os valores obtidos para os diferentes parâmetros bioquímicos estiveram sempre dentro das faixas esperadas. As atividades de TGP, TGO e ALP foram determinadas pelo método UV otimizado (IFCC). A absorvância foi medida a 340 nm no espectrofotómetro, e os resultados expressos em U/L (23, 24).

Análise estatística

Os dados foram processados no GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EUA). A análise de variância (ANOVA) de um fator seguida do teste de Dunnett ou do teste de Tukey foi utilizada para a análise comparativa. Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão (DP) considerando um valor de p<0,05 como estatisticamente significativo.

Resultados

Análise Fitoquímica Preliminar e Capacidade Antioxidante Total do Extrato de A. edulis

O teor de TPC, TAC e fitoquímicos do extrato etanólico de A. edulis são apresentados na Tabela 1. Observou-se que a IC50 do extrato foi menor que a IC50 do controlo, sugerindo uma alta capacidade antioxidante do extrato utilizado. A presença de taninos, antraquinonas, glicosídeos de antraquinonas, flavonoides e triterpenoides foi evidenciada após análise fitoquímica preliminar do extrato de A. edulis (Tabela 2).

Toxicidade aguda e efeito comportamental

O ensaio de toxicidade aguda realizado seguindo o Teste nº 420 da Organização para Cooperação e Desenvolvimento Económico determinou que o extrato não apresenta toxicidade aguda letal, não foi evidenciada mortalidade. Nenhuma diferença no peso corporal ou evidência de danos no fígado, pulmão, pâncreas, coração ou rim após 14 dias foi detetada (19). O consumo de água e ração comparado ao grupo controlo foi semelhante durante o período de observação. As respostas aos estímulos nociceptivos, comportamento, higiene e reflexo postural mantiveram-se normais e controladas após o tratamento.

Determinação do efeito hepatoprotetor de A. edulis contra os danos induzidos pelo paracetamol

No modelo de hepatotoxicidade utilizado, a lesão hepática aguda foi induzida nos animais ao quarto dia de tratamento, exceto nos animais do grupo controlo que foram tratados com o solvente do extrato.

As medições foram feitas no soro dos animais obtidos no final da experimentação após a anestesia verificando a atividade sérica da TGP (U/L). Ao comparar os valores obtidos nos grupos controlo e patológico (APAP), verificou-se diferença estatisticamente significativa (p<0,0001) o que indicou que a dose de paracetamol utilizada efetivamente induz lesão hepática nestes animais experimentais, considerando a elevação deste parâmetro no grupo APAP. Além disso, também foi verificada diferença estatisticamente significativa entre o grupo APAP e o grupo SM tratado com silimarina, referência para efeito hepatoprotetor, e entre o grupo APAP e os grupos Ae50, Ae100, Ae200 e Ae400, que foram tratados com diferentes doses do extrato etanólico de A. edulis (50, 100, 200 e 400 mg/kg respetivamente). O nível sérico de TGP foi menor em todos os grupos tratados com o extrato, bem como no grupo SM. Por fim, não foi observada diferença estatística entre os grupos tratados com extrato ou com silimarina e o grupo controlo (Figura 1).

A atividade TGO sérica (U/L) dos diferentes grupos também foi medida (Figura 2). Os resultados mostraram que ao comparar os valores obtidos no grupo controlo e no grupo patológico (APAP), uma diferença estatisticamente significativa foi evidenciada (p<0,0001) com destaque para o APAP. Isso indicou, novamente, a validade do método usado para avaliar a atividade hepatoprotetora do extrato. Adicionalmente, ao comparar os dados dos níveis séricos de TGO dos animais do grupo APAP com os dados dos grupos SM (tratados com silimarina, p<0,01), Ae50, Ae100, Ae200 e Ae400 (50, 100, 200 e 400 mg/kg de A. edulis, respetivamente, p<0,0001), foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre eles, com a silimarina a reduzir os valores de TGO. Além disso, não foi observada diferença entre os grupos que receberam o extrato ou a silimarina e o grupo controlo.

A atividade da fosfatase alcalina sérica (ALP) no grupo tratado com silimarina (SM) apresentou decréscimo estatisticamente significativo quando comparado ao grupo com hepatite tóxica induzida por paracetamol (p<0,05) (Figura 3). Os demais grupos tratados não apresentaram diferença significativa em relação ao grupo patológico, com valores de AF semelhantes entre todos.

Discussão

O teste de toxicidade do extrato etanólico de A. edulis em murganho mostrou que até a dose de 2000 mg/kg não causou alterações morfoanatómicas nos principais órgãos estudados nem a morte do animal. Ou seja, de acordo com a OCDE, a sua aplicação oral é segura. Este resultado está relacionado com o que foi demonstrado utilizando doses semelhantes de extrato aquoso de A. edulis em ratos Wistar, ou seja, não foi observada evidência de toxicidade. Com doses muito altas (5000 mg/kg) foi encontrada uma alteração no peso do fígado, o que sugere sinais de toxicidade no órgão (12). Seguindo as diretrizes da OCDE, doses de até 2 g/kg foram utilizadas neste estudo (19). Da mesma forma, a baixa toxicidade de A. edulis foi relatada em modelos in vitro com Artemia salina (25). Os resultados obtidos ao avaliar o efeito do extrato etanólico de A. edulis sobre o comportamento geral de murganhos também mostraram a ausência de efeitos gerais sobre parâmetros autonómicos ou etológicos, como letargia, disúria, vómito ou regurgitação, diarreia, motilidade espontânea, defecação, piloereção, fotofobia e xerostomia.

Foi relatado que A. edulis contém flavonoides, compostos fenólicos, triterpenoides, antraquinonas, e que não contém saponinas em extratos aquosos e etanólicos (10,25), o que coincide com resultados obtidos neste estudo. Outros autores relataram a presença de alcalóides, o que difere de nossos resultados (26).

O conteúdo fenólico no extrato foi de 36,954 ± 0,379 mg GAE/100 g, enquanto o descrito noutro estudo utilizando extrato etanólico de A. edulis foi de 17,6 ± 0,6 mg GAE/100 g e para o extrato aquoso foi de 9,0 ± 0,2 mg GAE/100 g (12). Essa diferença pode ser devido à diluição utilizada pelos autores (200 µg/mL), ou ao tempo decorrido após a reação até a medida da absorvância (2 horas), que difere ligeiramente do que é usado no nosso estudo.

A atividade antioxidante expressa em IC50 foi maior (36,954±0,379 mg GAE/100g) do que a descrita noutro estudo utilizando extrato etanólico de A. edulis (17,6±0,6 mg GAE/100g) e outro extrato aquoso (9,0±0,2 mg GAE/100g) relatados anteriormente (12), essa diferença pode ser devido às diluições utilizadas e às condições do ensaio. Os resultados deste estudo são semelhantes aos dados descritos para a fração de acetato de etilo (27). O extrato de A. edulis apresentou maior capacidade antioxidante (menor IC50) do que a substância de referência TROLOX (Tabela 1). Tem sido relatado que a capacidade antioxidante de A. edulis está relacionada com o teor de TPC do extrato (12). Por outro lado foi relatada uma atividade antioxidante moderada do óleo essencial de A. edulis e do seu principal componente viridiflorol (28). Além disso, o extrato aquoso doutro membro deste género, A. rubifolius, exibiu uma alta atividade antioxidante (IC50 7,1±0,1 μg/mL) no ensaio DDPH (29).

Relativamente ao estudo do efeito do extrato no modelo de hepatotoxicidade induzida por APAP em murganhos, foi determinado que o grupo patológico apresentou um aumento na atividade de TGP e TGO em relação ao grupo controlo (p<0,0001), uma vez que o metabolismo do APAP e necrose hepática são os principais eventos durante as primeiras horas após a administração de APAP (22). Uma redução significativa (p<0,0001) das enzimas hepáticas TGP e TGO, também, foi encontrada em animais tratados com todas as doses de extrato de A. edulis em relação ao grupo controlo. Esse resultado é semelhante ao observado no grupo tratado com silimarina (TGP p<0,0001 e TGO p<0,01). No caso da silimarina, esse resultado era espectável, considerando que é o fármaco hepatoprotetor de referência (30).

No que diz respeito à atividade da ALP, verificou-se que apenas o grupo tratado com silimarina apresentou redução estatisticamente significativa em relação ao grupo patológico (p<0,05), nos demais grupos não foi observada diferença com o grupo APAP. Isso pode ser porque essa enzima não é um marcador específico do fígado e, portanto, a presença de uma alteração no nível de ALP nem sempre é indicativa de dano hepatocelular (31), mas quando há obstrução hepática do fluxo biliar pode ser elevado (32). Além disso, o tempo decorrido para a colheita da amostra após a administração de APAP no modelo de hepatotoxicidade utilizado não é suficiente para causar danos nesse nível.

Em termos gerais, os valores semelhantes foram observados nos parâmetros TGP e TGO nos animais tratados com as diferentes doses de extrato de A. edulis e nos tratados com silimarina, o que pode ser devido às propriedades antioxidantes de A. edulis que está associada à presença de compostos fenólicos, e concorda com o que foi encontrado anteriormente num estudo in vitro (7). A lesão hepática causada no modelo de hepatotoxicidade utilizado envolve stress oxidativo (30).

A este propósito devemos referir que o papel dos compostos fenólicos de origem natural na hepatoproteção já se encontram descritos (33). Esses compostos podem estabilizar os radicais livres gerados pela inibição da formação e expressão de citocinas inflamatórias, interleucinas, fator de crescimento transformador β (TGF-β) e fator de necrose tumoral α (34). Finalmente, a regulação da expressão de vários genes também foi descrita de acordo com o modelo de hepatotoxicidade estudado (33).

Conclusão

Neste estudo demonstramos que o extrato etanólico de A. edulis é seguro para administração oral nas doses testadas, não afetando o comportamento ou atividade geral dos murganhos. Observou-se que o extrato de A. edulis possui capacidade antioxidante, relacionada com a presença de compostos fenólicos totais, como taninos e flavonoides. Por fim, de acordo com os resultados obtidas no teste de lesão hepática induzido por paracetamol em murganhos, o extrato possui atividade hepatoprotetora, que pode estar associada à sua atividade antioxidante.

Declaração de contribuições dos autores

Todos os autores fizeram contribuições substanciais para este trabalho, leram o manuscrito final e aprovaram a submissão. AKG, JRC, MSS, MACB, LK colaboraram na conceção e desenho de experimentos biológicos, aquisição de dados, análise e interpretação de dados, análise estatística. LGM e AKG realizaram os ensaios de antioxidantes. A escrita do manuscrito foi feita por MACB e LK. Todos os autores participaram da revisão crítica e aprovação final.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Professor G. Delmás, do Departmento de Botanica da Facultad de Ciencias Químicas pela recolha e identificação das planats; ao Sr N. Kennedy pela ajuda na transversão do texto para língua inglesa.

Conflito de interesses

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Financiamento

Esta investigação foi apoiada pela Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Assunção, Paraguai. A AKG realizou o trabalho durante o mestrado (MCQB) apoiado pela CONACYT, Paraguai (PROCIENCIA POSG16-160)

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