doi: 10.19277/bbr.18.2.272.pt

Ciências Biofarmacêuticas, Biomed Biopharm Res., 2021; 18(2):274-290

doi: 10.19277/bbr.18.2.272; [+] versão PDF aqui; [+] versão inglês html aqui

 

Efeito protetor de Cecropia pachystachya contra a citotoxidade do preproIAPP é independente da homeostasia do Ca²⁺: conhecimento revelado por um modelo de levedura de desregulação de Ca2+ mediada pelo preproIAPP

Sofia Ferreira 1, Rejane G. Tavares 1,2, Ana F. Raimundo 3,4,5, Francieli M. Stefanello 6, Flavio H. Reginatto 7, Nuno Saraiva 1, Regina Menezes 1,3,5*

1CBIOS - Center for Biosciences & Health Technologies, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, Campo Grande 376, 1749-024 Lisboa, Portugal; 2Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Alimentos, Faculdade de Nutrição, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil; 3iBET - Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Apartado 12, 2781-901 Oeiras, Portugal; 4ITQB-NOVA, Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier, Universidade Nova de Lisboa, Av. da República, 2781-157 Oeiras, Portugal; 5CEDOC, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa, Campo dos Mártires da Pátria, 130, 1169-056 Lisboa, Portugal; 6Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Bioprospecção, Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil; 7Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil

*autor para correspondência: Este endereço de email está protegido contra piratas. Necessita ativar o JavaScript para o visualizar.

 

Resumo

Apesar dos avanços na terapêutica, a diabetes tipo 2 é uma epidemia com números alarmantes a nível mundial. Novas estratégias de prevenção e tratamentos são imperativas. Um potencial alvo de investigação é a agregação do Polipéptido Amilóide dos Ilhéus (IAPP), um dos responsáveis pela disfunção das células-β pancreáticas. Para estudar o impacto do IAPP na sinalização do cálcio (Ca2+), desenvolvemos um modelo de levedura com um duplo sistema de reporte que, de forma independente, expressa preproIAPP (ppIAPP) e possui o gene lacZ sob o controlo da região promotora do Crz1. Neste sistema, o ppIAPP induziu uma ativação exacerbada do Crz1, um fator de transcrição ativado pela via Ca2+/calmodulina/calcineurina. Com base nos efeitos medicinais descritos para plantas Urticaceae, testámos o potencial protetor de Cecropia pachystachya contra a citotoxicidade induzida pelo IAPP no modelo de levedura desenvolvido. Embora o extrato de C. pachystachya não tenha atenuado a toxicidade do ppIAPP, o tratamento com a fração enriquecida de C. pachystachya (EFF-Cp) melhorou significativamente a viabilidade celular. A bioatividade do extrato e fração de C. pachystachya na regulação da homeostasia do Ca2+ foi também avaliada. Nenhum dos tratamentos impediu a ativação do Crz1, sugerindo que a proteção conferida pela EFF-Cp contra a toxicidade do ppIAPP é mediada por mecanismos independentes do Ca2+.

 

Palavras-chave: Amilina; Cecropia pachystachya; Diabetes; Polipéptido Amilóide dos Ilhéus (IAPP); Sinalização do cálcio

Recebido: 02/12/2021; Aceite: 31/12/2021

 

Introdução

A diabetes é a doença metabólica mais prevalente, apresentando um grande impacto social e económico em todo o mundo. Tendo uma origem multifatorial, vários fatores contribuem para o desenvolvimento e progressão desta doença. A principal característica patológica da diabetes é o elevado nível de glucose no sangue como resultado da resistência à insulina e/ou produção e secreção insuficiente de insulina por parte das células-β pancreáticas disfuncionais (1). Um dos principais contribuintes para o dano das células-β na diabetes é a agregação do Polipéptido Amilóide dos Ilhéus (IAPP), igualmente conhecido por amilina, uma hormona co-produzida com a insulina nas células-β em resposta aos níveis de glucose no sangue (2). Durante a sua síntese, as formas imaturas de IAPP são sequencialmente processadas por enzimas convertases até originarem uma molécula de IAPP madura e funcional, de 37 aminoácidos, que atua em sinergia com a insulina para a homeostasia da glucose. Em condições de pré-diabetes/diabetes, o aumento na produção de insulina induzido pela hiperglicemia é acompanhado por uma produção exacerbada de IAPP. Tal leva à sobrecarga da maquinaria de processamento das células-β e à consequente acumulação intracelular de espécies imaturas de IAPP altamente amiloidogénicas (3). Várias evidências descrevem que os oligómeros intracelulares de IAPP que se formam durante este processo são as entidades tóxicas, prejudicando a maioria das funções vitais das células-β. Entre outros fatores, afetam a proliferação celular, aumentam o stress do Retículo Endoplasmático (ER), prejudicam a autofagia e a função mitocondrial e exacerbam a inflamação local (4-7). Em conjunto, todos estes eventos culminam na lesão das células-β e, em última instância, contribuem para o desenvolvimento da doença.

Segundo algumas evidências, os oligómeros de IAPP interferem com a estrutura e dinâmica da membrana celular, originando poros iónicos que permitem a entrada descontrolada de iões de Ca²⁺ para o interior da célula, levando à ativação da cascata de apoptose (10-11). Por outro lado, a desregulação dos níveis de Ca²⁺ nas células-β tem vindo a ser associada a características importantes da diabetes, nomeadamente, a resistência à insulina (12). Alterações nos níveis citosólicos de Ca²⁺ desempenham um papel crucial no controlo da secreção fisiológica de insulina pelas células-β do pâncreas. Como resultado do metabolismo da glucose, os níveis de ATP intracelular aumentam, induzindo a inibição dos canais de potássio situados na membrana e regulados pelo ATP. Consequentemente, a membrana plasmática sofre uma despolarização, alterando o potencial elétrico que induz a abertura dos canais de Ca²⁺ dependentes de voltagem. O influxo de iões Ca²⁺ desencadeia a libertação de grânulos secretores, que transportam insulina, por exocitose. Alterações descontroladas nos níveis de Ca²⁺ têm sido observadas numa vasta gama de células e tecidos (por exemplo, plaquetas, cardiomiócitos, células-β, músculo, rim, fígado, adipócitos, osteoblastos, entre outros) tanto em doentes com diabetes tipo 2, como em modelos animais (12-13).

Nas últimas décadas, diversos estudos descreveram o potencial dos fitoquímicos de origem natural na prevenção e controlo de alterações metabólicas associadas às doenças crónicas. Algumas plantas do género Cecropia (Urticaceae), nativas da América Central e do Sul e conhecidas como “embaúba” na gíria popular (14), são um exemplo desse caso. Em particular, as folhas de Cecropia pachystachya têm sido amplamente reportadas como tendo propriedades hipoglicémicas, diuréticas, anti-inflamatórias e antioxidantes (14–19). Além das suas propriedades contra distúrbios metabólicos, estudos in vivo descreveram o efeito de frações enriquecidas de C-glicosil flavonóides e/ou extratos aquosos de folhas de C. pachystachya também ao nível do sistema nervoso central (20-22). Por outro lado, estudos in vitro demonstraram que extratos de C. pachystachya são tóxicos para vários tipos de células cancerígenas (15-19). As propriedades farmacológicas de C. pachystachya foram correlacionadas com o seu conteúdo rico em compostos fenólicos, principalmente ácido clorogénico, isoorientina, orientina, isovitexina e isoquercitrina (21-22).

Neste estudo, investigámos a potencial ação protetora de extratos e frações de C. pachystachya em modelos de Saccharomyces cerevisiae que recapitulam a toxicidade induzida pelo IAPP (23).

Material e Métodos

Material vegetal

Partes aéreas de folhas de C. pachystachya Trécul foram recolhidas em Torres, RS, Brasil. A espécie ICN 150025 foi depositada no Herbário da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, Brasil. O acesso à biodiversidade brasileira está registado no Sistema Nacional de Gestão para o Património Genético e Conhecimentos Tradicionais Associados (SISGEN) sob o protocolo AC5A37.

Preparação do extrato aquoso

As folhas de C. pachystachya foram secas ao ar (35–40^◦C) durante três dias e depois extraídas por infusão (1:10, planta/água destilada) durante 30 min. Seguidamente, foram filtradas, liofilizadas e armazenadas a -20^◦C até posterior uso (22).

Preparação das frações enriquecidas

A fração enriquecida de C-glicosil flavonóide (EFF-Cp) foi obtida conforme descrito anteriormente por Ortmann et al. (2016) (21). O material vegetal seco foi submetido ao procedimento de extração com etanol 20% e o extrato foi fracionado com n-butanol, originando a fração n-butanólica. A fração butanólica foi seca sob pressão reduzida e agitada com a resina Amberlite^® XAD-16 (Sigma-Aldrich^®, St Louis, MO, EUA). Em seguida, a resina foi agitada novamente na presença de metanol por 30 min produzindo a EFF-Cp.

Caracterização química do extrato e frações

O extrato foi analisado quimicamente por HPLC/DAD conforme descrito anteriormente por Costa et al. (2011) (24) e Ortmann et al (2016) (21) usando um sistema de HPLC Perkin Elmer Série 200 com um Detetor “Photo Diode Array (PDA) (PerkinElmer, Shelton, CT, EUA).

Estirpes de levedura e plasmídeos

As estirpes de S. cerevisiae usadas neste estudo estão listadas na Tabela 1. A estirpe YAA5, que codifica o gene de fusão CDRE-lacZ, foi usada para ensaios de viabilidade celular e avaliação da atividade da β-galactosidase. A estirpe parental BY4742 e as estirpes YAA6 e YAA7 foram usadas como controlos negativos apenas para os ensaios de atividade da β-galactosidase. Os plasmídeos usados estão listados na Tabela 2. O protocolo de transformação das leveduras foi realizado segundo o método de acetato de lítio (25).

Condições de crescimento

Meio sintético com 2% de glucose foi usado para o crescimento de células transformadas com os plasmídeos de interesse. Um pré-inóculo foi preparado em meio sintético com rafinose e as culturas foram incubadas durante a noite a 30°C sob agitação orbital. As culturas foram diluídas em meio fresco e incubadas nas mesmas condições até que a densidade ótica a 600 nm (OD₆₀₀) atingisse a fase de crescimento logarítmico. A seguinte equação foi usada para sincronizar as culturas: ODi × Vi = ODf / [2 (t / gt)] × Vf, onde ODi é a densidade ótica inicial da cultura, Vi é o volume inicial da cultura, ODf é a densidade ótica final da cultura, t é o tempo, gt é o tempo de geração da estirpe e Vf é o volume final da cultura. As culturas de células foram diluídas conforme indicado para cada ensaio. Em todas as experiências, a indução da expressão do IAPP foi realizada em meio sintético com galactose. A composição de todos os meios encontra-se detalhada em Raimundo et al. (2020) (23).

Citometria de fluxo

As culturas de células foram diluídas para uma OD₆₀₀ de 0,1±0,01 em meio sintético com galactose e incubadas com 0, 50 e 100 µg/mL de EFF-Cp ou extrato aquoso de C. pachystachya, a 30°C durante 20 h sob agitação orbital. As células foram incubadas com iodeto de propídio (PI) (Merck, Darmstadt, DE) numa concentração final de 2,5 μg/ml durante 30 min, a 30°C sob agitação orbital e protegidas da luz. A citometria de fluxo foi realizada usando um citómetro de fluxo BD FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). A aquisição e análise de dados foram realizadas com os programas CellQuest^® ((BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e FlowJo^® (Tree Star Inc., San Carlos, CA, EUA), respetivamente. Um mínimo de 50000 eventos foi analisado por cada experiência. A exclusão de dupletos celulares foi realizada com base na dispersão dos parâmetros “Forward”-A e -W.

Atividade da β-galactosidase

Os ensaios da β-galactosidase para inferir a homeostasia do Ca²⁺ foram realizados conforme descrito por Garcia et al. (2106) (26). Resumidamente, as culturas com uma OD₆₀₀ = 0,5 ± 0,05 foram diluídas em meio sintético com galactose para uma OD₆₀₀ = 0,1 ± 0,01. De seguida, foram transferidas para uma microplaca de 96 poços e incubadas com 0 ou 50 µg/mL de EFF-Cp ou extrato aquoso de C. pachystachya, durante 20 h a 30°C sob agitação orbital. Após este período, a OD₆₀₀ das culturas foi medida, 10 μL de cada suspensão de células foram transferidos para uma nova placa de 96 poços seguido pela adição de 20 μL de reagente de lise celular Y-PER (Thermo Fisher Scientific Inc.–Life Technologies, EUA). A placa foi incubada durante 20 min a 37^◦C sem agitação. 240 μL de tampão lacZ [8,5 g/L Na₂HPO₄ (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, DE), 5,5 g/L NaH₂PO₄.H₂O (Merck, Darmstadt, DE), 0,75 g/L KCl (Panreac, Bracelona, ES), 0,246 g/L MgSO₄.7H₂O (Merck, Darmstadt, DE) contendo 4 mg/L o-nitrofenil β-D-galactopiranosídeo (ONPG) (Sigma-Aldrich^®)] foram adicionados a cada poço, e a placa foi incubada a 30^◦C por 2 h. Os resultados foram expressos como unidades de Miller (26), aplicando-se a seguinte equação, onde V = volume da cultura testada em mL e t = tempo de reação em minutos:

Unidades de Miller = 1000 × (OD₄₂₀-1,75 × OD₅₅₀) / (t × V × OD₆₀₀)

Análise estatística

A análise estatística foi realizada usando o programa Graphpad Prism 8. Os dados representam a média ± desvio padrão de pelo menos três réplicas biológicas independentes. A análise ANOVA unilateral com o teste de comparação múltipla de Dunnet foi realizada para avaliar as diferenças entre as condições. O teste t foi usado para aferir as diferenças entre as condições p426 e ppIAPP-GFP não tratadas na análise de citometria de fluxo. A análise ANOVA bilateral com o teste de comparação múltipla de Tukey ou Sidak foi realizada para avaliar as diferenças entre as condições nos ensaios da β-galactosidase.

Resultados e Discussão

Desenvolvimento de um modelo de levedura para avaliar os efeitos do ppIAPP na sinalização do Ca²⁺

A secreção de insulina, sobrevivência, proliferação e função das células-β são controladas pela dinâmica do Ca²⁺. Para determinar o efeito do IAPP na sinalização do Ca²⁺, recorremos a uma estratégia previamente descrita para recapitular as vias moleculares de agregação do IAPP no organismo modelo Saccharomyces cerevisiae (23).

Para tal, utilizámos a estirpe YAA5 que codifica o gene lacZ sob o controlo de elementos de reconhecimento do Crz1 (Tabela 1), o fator de transcrição de levedura que é regulado pela via calmodulina (CaM)/calcineurina (CaN) (27) e que, portanto, é sensível aos níveis intracelulares de Ca²⁺. Através de um mecanismo semelhante ao seu ortólogo humano NFAT, a ativação do Crz1 é regulada pelas concentrações citosólicas de Ca²⁺. Ligeiras oscilações nos níveis deste ião desencadeiam a ativação da CaM/CaN levando à desfosforilação do Crz1, translocação nuclear e estimulação da expressão de genes que se encontrem a jusante da região promotora do Crz1. Com base nesta via, o grau de ativação do Crz1 pode assim ser monitorizado através da atividade da β-galactosidase. As estirpes YAA6 e YAA7, cujos genes CRZ1 e CNB1 (que codificam a subunidade reguladora do complexo CaN) foram deletados, respetivamente, foram usadas como estirpes de controlo (Tabela 1).

Os novos modelos de levedura YAA5_ppIAPP-GFP, YAA6_ppIAPP-GFP e YAA7_ppIAPP-GFP representam as estirpes YAA5, YAA6 e YAA7, respetivamente, geneticamente modificadas para codificar a forma mais imatura e tóxica do IAPP (pré-pro-IAPP, ppIAPP) fundida com a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controlo transcricional do promotor indutível GAL1 (Figura 1A). Conforme descrito anteriormente por Raimundo et al. (2020) (23), no modelo de levedura desenvolvido, a expressão desta construção induz uma maior toxicidade ao nível do crescimento e viabilidade celular comparativamente às fusões que possuem as formas parcial ou totalmente processadas de IAPP. Por esse motivo, no presente estudo, decidimos não incluir fusões de proIAPP-GFP e IAPP-GFP.

A expressão do ppIAPP-GFP induziu uma forte ativação da via CaM/CaN na estirpe YAA5, conforme indicado pelo aumento da atividade da β-galactosidase (Figura 1B). Tal resultado é consistente com os estudos que reportam os efeitos dos péptidos amilóides na disrupção da homeostasia do Ca²⁺ e aumento desregulado nos níveis de Ca²⁺ citosólico. Por comparação, em células YAA6 e YAA7 apenas uma atividade residual do Crz1 foi observada. Da mesma forma, na estirpe parental BY4742 desprovida da construção CDRE-lacZ, a atividade da β-galactosidase foi quase indetetável (Figura 1B). Estes dados confirmam o nosso modelo de levedura como uma plataforma robusta para a bioprospecção de compostos com potencial para inibir a ativação exacerbada do Crz1 induzida pelo ppIAPP.

Caracterização química do extrato e fração de Cecropia pachystachya

Os perfis cromatográficos do extrato e fração de C. pachystachya foram semelhantes aos descritos por Gazal et al. (2014) (22), indicando a presença de concentrações semelhantes dos compostos principais, nomeadamente, ácido clorogénico, isoorientina, orientina, isovitexina e isoquercitrina (dados não mostrados).

A fração de Cecropia pachystachya (EFF-Cp) protege as células YAA5 contra a toxicidade induzida pelo ppIAPP

O potencial protetor dos fitoquímicos provenientes de fontes naturais tem sido amplamente explorado como uma abordagem alternativa no combate a alterações metabólicas observadas em diversas doenças crónicas. Mais especificamente, a bioatividade de C. pachystachya foi associada à promoção da saúde metabólica por mecanismos que incluem a regulação do controlo glicémico, inflamação e stress oxidativo (14-17, 19).

A levedura S. cerevisiae tem sido considerada uma plataforma robusta para o rastreio inicial de compostos com atividade citoprotetora que, posteriormente, são validados em modelos mais complexos (28-30). Entre outras características, tal é possível porque a S. cerevisiae compartilha mecanismos moleculares e celulares altamente conservados com os seus homólogos humanos.

Neste estudo, a estirpe YAA5_ppIAPP-GFP foi usada para investigar a potencial ação protetora de C. pachystachya em relação à citotoxicidade induzida pelo IAPP. Primeiramente, a expressão de ppIAPP-GFP foi confirmada por citometria de fluxo, mostrando que quase 30% da população total de células possui sinal de GFP na condição controlo (Figura 2A, 2B). Curiosamente, a incubação com a EFF-Cp induziu uma redução dependente da dose na percentagem da população de células positivas para GFP nas leveduras que expressam o ppIAPP-GFP. No entanto, mais estudos serão necessários para desvendar o real impacto do tratamento com a EFF-Cp na expressão do péptido de fusão ppIAPP-GFP.

De seguida, a integridade da membrana foi determinada usando a marcação de PI como medida para inferir a viabilidade celular. A construção ppIAPP-GFP induziu toxicidade após 20 h de incubação na presença de galactose (Figura 3A). Relativamente ao tratamento, o extrato de C. pachystachya e EFF-Cp não afetaram a viabilidade celular nas leveduras controlo (Figura 3B). Porém, o tratamento com EFF-Cp reduziu significativamente os efeitos tóxicos mediados pelo ppIAPP-GFP nas concentrações de 50 e 100 µg/mL, o que foi deduzido pela diminuição da percentagem de células positivas para PI para valores semelhantes à condição controlo (Figura 3C).

A ação protetora exercida pela EFF-Cp pode estar associada, pelo menos em parte, ao ácido clorogénico e à isoorientina, dois dos principais compostos identificados nesta fração e que já foram anteriormente associados a ações protetoras contra a diabetes. Relativamente à patologia do IAPP, o ácido clorogénico demonstrou inibir a oligomerização/formação de fibrilas de IAPP humano (hIAPP) e melhorar a viabilidade celular em células pancreáticas expostas a agregados de hIAPP. Ao atrasar a conversão da estrutura secundária do hIAPP para a estrutura β, o ácido clorogénico redireciona as moléculas amiloidogénicas para intermediários que são menos tóxicos para as células (31). Além disso, num modelo de ratos com diabetes tipo 2, este composto também demonstrou diminuir a glucose no sangue em situações de jejum, reduzir os níveis de produtos de peroxidação lipídica (LPO) e hemoglobina glicada (HbA1C), bem como aumentar os níveis de insulina plasmática, hemoglobina total, péptido-C e glicogénio (32-33). Atualmente, argumenta-se que os efeitos hipoglicémicos do ácido clorogénico podem estar relacionados com a inibição da glucose-6-fosfato desidrogenase, regulando o equilíbrio da glucose no sangue in vivo. Além disso, estudos têm demonstrado que o ácido clorogénico pode ainda ativar a proteína quinase ativada pelo AMP (AMPK), estimular a absorção de glucose no músculo esquelético, inibir a gluconeogénese e reduzir a síntese de ácidos gordos (34). No fígado, a atividade do ácido clorogénico também tem sido associada à redução do stress oxidativo, stress do reticulo endoplasmático, aumento da autofagia e melhoria da atividade mitocondrial (35). De modo semelhante, os principais compostos flavonóides da EFF-Cp, nomeadamente a orientina e seu isómero isoorientina, também foram descritos como potentes reguladores do stress oxidativo. Além disso, a isoorientina atua melhorando a sensibilidade à insulina e limitando a acumulação de lipídos tanto em animais diabéticos como em adipócitos presentes em cultura (36). Posto isto, é plausível considerar que a proteção conferida pela EFF-Cp no modelo de levedura aqui apresentado pode ser atribuída à ação combinada de dois grandes eventos moleculares: (a) modulação da agregação tóxica do IAPP e (b) mitigação do desequilíbrio redox induzido pelo IAPP.

Bioatividade de Cecropia pachystachya não está relacionada com a via de sinalização do Ca²⁺

Os níveis citosólicos de Ca²⁺ regulam um amplo número de processos celulares, incluindo o metabolismo, proliferação, transcrição e secreção. Nas células-β, a exocitose dos grânulos de insulina é rigidamente controlada por um equilíbrio bem ajustado entre as vias de influxo e efluxo de Ca²⁺. Alterações na dinâmica do Ca²⁺ têm sido associadas à secreção deficiente de insulina e disfunção das células-β (37), representando assim um alvo interessante para uma abordagem terapêutica.

Embora não haja nenhuma correlação evidente entre a bioatividade de Cecropia pachystachya e a via de sinalização do Ca²⁺, o ácido clorogénico (um dos principais componentes da EFF-Cp) foi descrito como sendo capaz de suprimir o influxo desregulado de Ca²⁺ proveniente do retículo endoplasmático e do ambiente extracelular em células endoteliais expostas a um fosfolipído tóxico (38).

Tirando partido do modelo de levedura desenvolvido neste estudo, recorremos a células YAA5_ppIAPP-GFP para rastrear a bioatividade do extrato e EFF-Cp de C. pachystachya na modulação da via de sinalização do Ca²⁺ e consequente ativação do Crz1. Uma vez que o tratamento com a concentração mais baixa (50 µg/mL) de EFF-Cp protegeu significativamente as células contra a toxicidade do ppIAPP-GFP, selecionámos esta concentração para realizar os testes adicionais. A incubação das células YAA5_ppIAPP-GFP com extrato de C. pachystachya não afetou a atividade da β-galactosidase (Figura 4), o que está de acordo com sua ineficácia na proteção das células contra a toxicidade induzida pelo ppIAPP-GFP no ensaio de viabilidade. Da mesma forma, em células que expressam ppIAPP-GFP, nenhuma alteração na ativação do Crz1 foi observada após o tratamento com EFF-Cp. Uma vez que a EFF-Cp não é capaz de inibir a hiperativação do Crz1, colocamos então a hipótese de que o seu mecanismo de proteção contra os efeitos tóxicos do ppIAPP esteja a ocorrer de forma independente da via CaM/CaN. Estudos adicionais serão necessários para compreender totalmente o modo de ação molecular e celular subjacente ao efeito protetor da EFF-Cp.

Conclusões

Através do desenvolvimento de um modelo de levedura que simultaneamente expressa ppIAPP e que atua como um sensor dos níveis intracelulares de Ca²⁺, o nosso estudo forneceu novos dados sobre a interferência do ppIAPP na sinalização deste ião. A expressão do ppIAPP induziu a hiperativação da atividade do Crz1, o que nos permitiu identificar a desregulação da sinalização do Ca²⁺ como um dos mecanismos patológicos subjacentes à citotoxicidade do ppIAPP. A par disto, demonstrámos também que a eficácia da EFF-Cp na melhoria da viabilidade celular não é mediada por alterações na sinalização do Ca²⁺, sugerindo que outros mecanismos podem estar associados a essa resposta protetora. Digno de nota, a composição química da EFF-Cp é enriquecida em ácido clorogénico e isoorientina, dois metabolitos secundários que exercem propriedades protetoras contra complicações diabéticas e efeitos patológicos do IAPP. Com base nas evidências relatadas, parece plausível levantar a hipótese de que a proteção celular mediada pela EFF-Cp pode incluir a mitigação do stress oxidativo, stress do reticulo endoplasmático, dano mitocondrial e autofagia. No entanto, mais estudos serão necessários para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à bioatividade da EFF-Cp.

Declaração sobre as contribuições do autor

RM e RT conceberam e desenharam as experiências. SF realizou as experiências. SF, RT, AFR, FMS, FHR, NS e RM analisaram os dados e escreveram o artigo. Todos os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versão submetida.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência e do Ensino Superior, números de bolsas PTDC/BIA-MOL/31104/2017 (RM) e UIDB/04567/2020 e UIDP/04567/2020 (CBIOS). A Unidade de Pesquisa iNOVA4Health (LISBOA-01–0145-FEDER-007344), que é co-financiada pela FCT/Ministério da Ciência e do Ensino Superior, por meio de fundos nacionais, e pela FEDER no âmbito do Acordo de Parceria PT2020, também é reconhecida. Os autores gostariam de agradecer à FCT pelo apoio financeiro prestado à AFR (PD/BD/135504/2018); SF (UI/BD/151421/2021) e RM (CEEC/04567/CBIOS/2020).

Conflito de interesses

 

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

 

Referências