doi: 10.19277/bbr.18.2.269.pt

Introdução

A importância da tomografia na medicina preventiva assim como na investigação biomédica está bem estabelecida. As técnicas de tomografia como a tomografia computorizada (CT) de fotão único (SPECT) e a tomografia por emissão de positrões (PET) oferecem diferentes resoluções de imagem e contraste, o que significa também diferentes aplicabilidades e custos. (1-4). Uma limitação desta tecnologia é a resolução espacial das imagens em tecidos profundos devido à difusão de luz (4,5). Avanços recentes em fotónica e imagem óptica chamam a nossa atenção para novos sistemas de tomografia óptica como a tomografia óptica difusa (DOT), a tomografia molecular fluorescente (FMT), a tomografia de bioluminescência (BLT), e a tomografia fotoacústica (PAT). Todos estes novos desenvolvimentos visam melhorar a sensibilidade e precisão, o que inclui a utilização de novos métodos de aprendizagem que proporcionam uma melhor e mais fiável análise de reconstrução (5,6).

A tomografia fotoacústica (PAT) é uma tecnologia de imagem que parece ser particularmente interessante, uma vez que combina princípios ópticos e de ultra-sonografia em alternativa á radiação ionizante clássica. É também conhecida como tomografia termoacústica (TAT) ou mais actualmente tomografia optoacústica (OAT). Esta tecnologia utiliza uma luz laser de diferentes frequências que aquece e expande o tecido alvo, criando uma onda sonográfica que pode ser medida à superfície da pele (6-9). Este sinal pode agora ser utilizado para produzir uma imagem através de algoritmos específicos de reconstrução. Um laser com compromentos de onda é utilizado para medir diferentes componentes biológicos. Em comparação com tecnologias semelhantes, várias vantagens podem ser identificadas. Pensando na clássica CT , PET e mesmo na RM, o PAT não utiliza radiação ionizante, é mais rápido, fácil de operar e menos dispendioso. Em comparação com o DOT ou com o FMT, o PAT mostra melhores capacidades de penetração com alta resolução, mostrando melhor contraste e menos artefactos do que a Sonografia (6-10) a tecnologia mais popular utilizada no diagnóstico cardiovascular (9,10).

As aplicações PAT expandiram significativamente nos últimos anos, desde a investigação básica até aplicações clínicas, também na medicina cardiovascular (10-13). Um desenvolvimento recente desta tecnologia - a tomografia optoacústica multiespectral (MSOT) fornece lasers com comprimentos de onda múltiplos que permitem identificar vários cromóforos sem agentes de contraste. Estes cromóforos podem ser considerados como biomarcadores endógenos de função microcirculatória, tais como hemoglobina oxigenada (HbO2), hemoglobina desoxigenada (Hb), ou a saturação média de oxigénio (mSO2) (14-18). Outros cromóforos como os lípidos, melanina e água podem também ser detectados e visualizados para análise funcional (10,16). No presente estudo exploramos o funcionamento e as capacidades do MSOT num conjunto de participantes humanos saudáveis.

Materiais e Métodos

Participantes

Esta amostra de conveniência envolveu seis participantes saudáveis de ambos os sexos (3 homens e 3 mulheres), de 18 a 60 anos (média+dp 36,70 ± 15,16) seleccionados segundo critérios específicos de inclusão / não-inclusão. Os participantes eram normotensos, não fumadores, e livres de qualquer medicação ou suplemento alimentar. As restrições incluíam o consumo de cafeína e álcool 24 horas antes das medições, e a utilização de quaisquer formulações tópicas (incluindo cosméticas) sobre a pele. Os participantes relataram actividade física regular e ausência de qualquer doença metabólica (diabetes, dislipidemia). A Tabela 1 reune a caracterização completa dos participantes. Todos os procedimentos seguiram os princípios estabelecidos pela Declaração de Helsínquia e subsequentes emendas (19) e foram previamente aprovados pela Comissão de Ética Institucional.

Tomografia Optoacústica Multi-Espectral e Análise de Imagem

Foi utilizado um sistema de imagem optoacústica MSOT da Acuity (iThera Medical GmbH, Munique, Alemanha). Este instrumento é composto por um laser Nd:YAG que fornece impulsos de excitação de 9 ns em comprimentos de onda de 680 nm a 980 nm. A taxa de repetição do sistema MSOT vai até 50 Hz com uma velocidade de afinação do comprimento de onda de 10 ms e uma energia de pico de pulso de 35 mJ a 730 nm. Um feixe de fibras integrado no detector fornece uma mancha de luz circular de aproximadamente 10 mm de diâmetro. A detecção ultra-sónica iThera MSOT é composta por 256 transdutores ultra-sónicos com uma frequência central de 8 MHz (60% de largura de banda), organizados numa matriz hemisférica de 98 graus de cobertura angular e um raio de curvatura de 30 mm. A luz laser é conduzida a uma sonda 3D por fibra óptica com 15 mm3. Após a digitalização, as imagens foram processadas para correcção da fluência, a focagem óptica dada pela velocidade do som e os sinais termoelásticos optoacústicos de cromóforos seleccionados Hb, HbO2 foram reconstruídos e a Região de Interesse (ROI) analisada com o software iThera Medical ViewMSOT.

O software ImageJ (National Institutes of Health, USA v.1.53k14 de 26 de Junho de 2021) foi utilizado para trabalhar com imagens reconstruídas a partir de imagens individuais de varrimentos dos eixos X, Y e Z.

Procedimento experimental

O aspecto ventral do antebraço, escolhido aleatoriamente em cada participante, foi previamente tratado com a remoção química do pêlo corporal, e marcado para aplicação da sonda (4,20). Em seguida, a sonda MSOT 3D foi aplicada e focalizada numa orientação fixa. Uma fina camada de gel para sonografia foi aplicada no detector 3D do MSOT antes do contacto com a pele para proporcionar melhores condições de aquisição de imagem. O detector 3D do MSOT foi bloqueado na posição com um braço desenhado com a tecnologia da ITEM - Engeneering (Solingen, Alemanha) (Figura 1).

Estatística

A análise estatística foi realizada com o GraphPad Prism 9.2.0, MachineID: 0861F12DB8D10, e a distribuição da normalidade testada com o Shapiro-Wilk e a observação directa das parcelas QQ. Todos os dados são apresentados como média±dp, excepto quando indicados de forma diferente. A significância foi observada através do teste t de comparações seleccionadas analisadas com 95% do nível de confiança.

Resultados e Discussão

O MSOT detecta vários cromóforos a uma taxa de repetição de 50 Hz com uma velocidade de afinação do comprimento de onda de 10 ms. Os comprimentos de onda MSOT variam desde o visível ao infravermelho (680 a 980 nm) permitindo abordar, de modo não invasivo uma grande profundidade (até 15 mm) em 2 segundos. A resolução microscópica das regiões seleccionadas produz dados de HbO2, Hb desoxigenada e melanina de imagens reconstruídas em 3D (utilizando um transdutor ultra-sónico de um único elemento e um sensor de ultra-sons curvo 2-D) referidos como os biomarcadores mais importantes da PAT (4,15,18,21,22).

As imagens adquiridas pelo MSOT correspondem a 15 mm3 em volume. Para cada varrimento, o sistema regista 10 frames para cada eixo X, Y e Z para cada cromóforo termoelástico produzindo um sinal entre 680 a 980nm (4,14,18,22). O MSOT pode virtualmente ser instruído para distinguir até três cromóforos termoelásticos diferentes certificados pela empresa iThera e carregados como programa de função antes de qualquer aquisição. Para o ensaio actual, a configuração carregada foi orientada para observar sinais de HbO2, Hb e melanina respectivamente. Enquanto se adquire sinal em qualquer região (por exemplo, a pele), é gerado um conjunto de imagens compostas pelos eixos XY, XZ, e YZ (Figura 2A). A 15 mm de profundidade, as imagens têm uma resolução de 150 µm, permitindo a identificação do primeiro e segundo plexos vasculares da pele (Figura 2B).

Resolução espectral e construção de imagens

Os objectos gerados durante a aquisição são tridimensionais (3D), e a vista de ecrã permite medições e anotações como mostra a Figura 2B. Para extrair dados das imagens adquiridas, a análise prévia requer a montagem de múltiplos sinais termoelásticos e o pós-processamento pelo software iThera MSOTview. Este processo segue uma sequência de reconstrução de sinais optoacústicos - a correcção da velocidade do som para calibração do melhor foco, aplicação de correcção de fluência, e cálculo de resolução espectral para os sinais adquiridos de HbO2, Hb e melanina (Figura 3A). Para melhor aquisição de sinais, o MSOT lê a extinção molar máxima de HbO2 a 950 nm, Hb a 750 nm e melanina a 680 nm (Figura 3B-D). Imagens representativas de cada um dos sinais adquiridos de HbO2, Hb e melanina demonstram a perfeita resolução dos sinais adquiridos em todos os eixos XY, XZ, e YZ e a montagem da respectiva imagem fundida (Figura 3A). Além disso, é gerada uma vista de imagem 2D+ para melhor navegação sobre as imagens 3D adquiridas e para ajustar adequadamente as intensidades de cor. As imagens monocromáticas são fundamentais para definir tabelas correctas de procura de cores e para estudar os sinais adquiridos de forma independente.

Reconstrução opto-acústica e análise da Região de Interesse (ROI)

Após reconstrução da imagem, correcção da fluência, ajuste da velocidade do som, resolução espectral, ajuste do equilíbrio da cor e saturação das tabelas de pesquisa preferidas, cada sinal cromóforo adquirido pelo MSOT pode ser analisado. Para superar o achatamento do sinal a partir da relação sinal-ruído resultante da análise de grandes imagens, os elementos de cada varrimento 3D têm de ser seleccionados como Regiões-de-Interesse (ROI) antes da análise dos dados. A análise ROI (representada na Figura 4A) segue a estrutura da microvasculatura em 9 de todos os 10 fotogramas adquiridos. Cada plano é de 150 µm de profundidade de tecido nos eixos X, Y e Z. Para adquirir dados de qualquer ROI, cada plano deve seguir o ROI seleccionado através de XZ (barra amarela em quadros representados) e YZ (barra verde em quadros representados) enquanto que uma ferramenta de selecção de polígono (área seleccionada magenta) delineia o ROI em XY (quadros azuis). Na visão geral da imagem 2D+, a área de análise 3D é construída (Figura 4A).

Biomarcadores

Através do MSOTview cada dado digitalizado de cada ROI exportado é fornecido em grupos de dez imagens resultantes da reconstrução optoacústica. A selecção do ROI das imagens MSOT adquiridas permite o cálculo do volume de ROI (mm3), concentração de HbO2 (em unidades arbitrárias a.u.), Hb desoxigenada (a.u.) e melanina (a.u.) (4,14,18,20).

Globalmente, a velocidade de aquisição de 10 imagens de 3 cromóforos sobre uma reconstrução de 6 comprimentos de onda (700 nm, 730 nm, 760 nm, 800 nm, 850 nm, e 900 nm) é constante a cada 2s. A estabilidade dos dados do ROI seleccionado é representada pela linearidade do sinal registado para HbO2, Hb desoxigenada e melanina (a.u.) (Figura 4B-D). A partir dos sinais de HbO2 e Hb, o MSOTview é capaz de calcular a hemoglobina total (HbT) e a saturação média de oxigénio (mSO2) (Figura 4E-F) (14).

O HbT calculado pelo MSOT (1.23E-04±2.75E-06 a.u) é portanto dado pela adição de Hb (de 4.00E-05±1.14E-06) e HbO2 (de 8.31E-05±2.21E-06) cujas intensidades de sinal são mostradas na Tabela 2. A avaliação dos dados presentes na Figura 5A resume os dados dos seis voluntários num total de dez imagens optoacústicas durante 2 s. Os dados de Hb (linha em azul) e HbO2 (linha em vermelho) correspondem consistentemente à sua adição como HbT (linha em rosa) ao longo das aquisições optoacústicas. Observamos também que em posição de repouso, a concentração de HbO2 é estatisticamente superior a Hb em todos os voluntários (Figura 5B), e que o valor de mSO2 está consistentemente a atingir acima do limite mínimo de saturação de oxigénio de 0,7 a.u. (Figura 5C).

A nossa abordagem está em linha com estudos previamente publicados que mostram que a aquisição de imagem com o sistema MSOT é extremamente intuitiva (mesmo em modo 3D). A discriminação da estratificação da microvasculatura da pele no plexo superior e inferior da pele é visualizada em direto em diferentes eixos (X, Y, Z) num volume de 15 mm3 (4,14-16). A aplicação da análise de ROI mostra um elevado potencial descritivo, pois permite ao MSOT avaliar independentemente o volume de sangue e a oxigenação dos diferentes plexos cutâneos em simultâneo com diferentes/ múltiplos ROI seleccionados. Além disso, o MSOT seleccionado oferece a possibilidade de adquirir e distinguir pelo menos três cromóforos independentes (Hb, HbO2, melanina no nosso estudo) em simultâneo.

Em qualquer caso, a estabilização total da sonda 3D durante a aquisição da imagem é fundamental para a qualidade da aquisição e para a análise dos dados, o que significa que a utilização de um suporte fixo para estabilizar a sonda é altamente recomendável.

Reconhecemos que o processamento de dados envolvido é complexo e requer uma experiência consistente por parte do operador. No entanto, as possibilidades oferecidas por este novo sistema em proporcionar novas perspectivas são imensas em especial na investigação vascular e podem ser alargadas para além do conhecimento actual.

Declaração sobre as contribuições do autor

LMR, TG, conceção e desenho do estudo; TG, SA implementação experimental; TG, análise e curadoria de dados; TG, LMR, redacção e revisão; LMR, supervisão e redação final.

Financiamento

Esta investigação é financiada pela ALIES e pela COFAC principais provedores da tecnologia em estudo, e pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) através da bolsa UIDB/04567/2020 à CBIOS.

Conflito de Interesses

Os editores envolvidos na autoria destes manuscritos não tiveram qualquer participação no processo de revisão ou decisão. Todos os autores declararam que não existem relações financeiras e/ou pessoais que possam representar um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Os autores gostariam de expressar os seus agradecimentos ao pessoal da CBIOS pelo seu esforço em fornecer toda a ajuda necessária, e a todos os participantes envolvidos no estudo.