10.19277/bbr.18.1.256.pt

Ciências Biofarmacêuticas, Biomed Biopharm Res., 2021; 18(1):123-138

doi: 10.19277/bbr.18.1.256; download da versão pdf [+] aqui 

 

Avaliação preliminar da segurança do n-butanol do processo de extração de colágeno e do extrato de colágeno da pele de Oreochromis niloticus (tilápia) para uso dermocosmético

1Universidad Nacional de Trujillo. Juan Pablo II Av. s/n, Trujillo, Perú; 2Department of Pharmacy, Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, Brazil; 3Universidad de Los Lagos. Fuschlocher Av. 1305, Osorno, Chile

*autores correspondentes: Este endereço de email está protegido contra piratas. Necessita ativar o JavaScript para o visualizar. e Este endereço de email está protegido contra piratas. Necessita ativar o JavaScript para o visualizar.

Resumo

A obtenção de novos ingredientes cosméticos, principalmente de fontes sustentáveis, como excipientes ou mesmo compostos ativos, é notável para a indústria cosmética para fórmulas dermocosméticas inovadoras. Assim, é essencial estabelecer a segurança desses novos ingredientes para evitar eventos adversos, principalmente aqueles associados aos efeitos clastogênicos dos compostos químicos utilizados para extração de colágeno. Avaliamos soluções de um composto químico utilizado no processo de extração de colágeno da pele de tilápia (Oreochromis niloticus). Os efeitos citotóxicos e genotóxicos das soluções utilizadas no processo de extração de colágeno foram de 10,0; 1,0; 0,5; 0,1; 0,05; e 0,025% de n-butanol. Estas foram avaliadas pelo teste de Allium e pelo ensaio do cometa em glóbulos brancos periféricos. Ademais, foram investigadas a água residual da última lavagem na fase pré-tratamento e o extrato de colágeno de tilápia liofilizado a 0,5%. A ausência de atividade citotóxica e genotóxica foi demonstrada no extrato de colágeno, apesar do n-butanol ter demonstrado dano ao DNA, tanto nas células radiculares de Allium cepa quanto nos glóbulos brancos do sangue periférico humano. Por isso, observamos a necessidade de realização de testes de genotoxicidade para garantir a ausência de contaminantes no extrato de colágeno para fins dermocosméticos.

 

Palavras-chave: Teste de Allium; extração de colágeno; ensaio de cometa; citotoxicidade; genotoxicidade; Oreochromis niloticus

Recebido: 26/02/2021; Aceite: 21/05/2021

Introdução

O uso sustentável de resíduos de organismos aquáticos foi amplamente estudado na última década com resultados interessantes (1,2). Uma vez que a origem e o método de extração exercem influência significativa sobre a pureza e rendimento do colágeno, há muitas revisões disponíveis sobre os recursos marinhos que discutem não apenas os fatores que influenciam a extração de colágeno, mas também suas propriedades físicas e biológicas, como sua estabilidade térmica, composição de aminoácidos e segurança orientada para dermocosméticos (1-4).

Além disso, inúmeros peptídeos bioativos de peptídeos de colágeno foram extraídos de peixes por hidrólise química ou enzimática, como opção mais segura no desenvolvimento de produtos cosmecêuticos. Entre as principais atividades, observam-se ação antimicrobiana, antioxidante, antifotoenvelhecimento, atividades fotoprotetoras e potencial aplicação na área cosmética (2).

De fato, há uma crescente utilização de colágeno de resíduos de peixes para aplicações cosméticas, uma vez que o colágeno de peixe não tem risco na transmissão de doenças para humanos. Por exemplo, alguns estudos se concentraram em aplicações de cicatrização de feridas com resultados bem-sucedidos, bem como diminuição da cicatrizes(1,5–7). Principalmente o colágeno de peixe derivado da pele da tilápia (Oreochromis niloticus) é altamente apreciado por seus usos biomédico e cosmético devido à propriedades físico-químicas particulares(8,9). Os resultados das avaliações biológicas do colágeno de tilápia demonstraram a ausência de toxicidade celular e aberrações cromossômicas, negativa em testes de sensibilidade e toxicidade sistêmica aguda (10). Também foram observadas a biocompatibilidade e a atividade regenerativa em queimaduras profundas de segundo grau (11). A segurança biológica do colágeno dependerá de sua pureza; portanto, é necessário avaliar os procedimentos de pré-tratamento e os métodos de extração.

Os métodos de extração de subprodutos de colágeno de diferentes animais são bem estabelecidos (10,12). O estágio anterior de tratamento, realizado para separar proteínas não colágenas, gorduras e pigmentos comuns, usam hidróxido de sódio e n-butanol em proporções de 1:20 peso/volume (p/v) (13,14). Após os tratamentos por períodos variáveis com esses compostos, sucessivos enxágues são realizados para descartar resíduos impregnados no colágeno extraído ou nos líquidos de lavagem. Essas moléculas representam uma fonte poluente para o meio ambiente e potencial genotoxicidade, como o peróxido de hidrogênio (15) e n-butanol (16).

A biossegurança das matérias-primas na indústria cosmética é obrigatória. Também é importante assegurar que as concentrações de substâncias químicas utilizadas durante os processos de extração de ingredientes cosméticos sejam eliminadas ou reduzidas (17), como o composto químico n-butanol. Para a extração de colágeno, é necessária cautela na eliminação do n-butanol, utilizado para a remoção de gorduras que permanecem nos subprodutos da matéria-prima de colágeno (14).

Apesar da ausência de mutações causadas pelo butanol no ensaio Ames (16), testes adicionais são necessários para confirmar esses resultados e especificar as concentrações utilizadas. Pesquisas atuais demonstram que um único ensaio não é suficiente para excluir uma substância genotóxica, mesmo quando o resultado foi negativo (17–20). Nesta pesquisa, avaliou-se a segurança de soluções químicas de n-butanol (utilizado no processo de extração), água residual de lavagens e extrato de colágeno da pele de O. niloticus para fins dermocosméticos, utilizando ensaios citotóxicos e genotóxicos por testes de Allium e cometa.

Material e Métodos

Material biológico

1) Bulbos de Allium cepa de tamanho médio, com disco germinal entre 1 e 2 cm.

2) Linfócitos sanguíneos periféricos obtidos de dois doadores masculinos saudáveis, não fumantes, que não consumiram drogas, com idades entre 25 e 38 anos (N°: 001-2020/CEI-UNT).

3) Tilápia (Oreochromis niloticus),12 meses de idade (30 peixes, 450 ± 35,0 g).

Produtos químicos

n-Butanol (1-butanol CAS 71-36-3) NaOH, ácido acético, peróxido de hidrogênio, NaCl, EDTA dissódico, Tris HCl, Triton X-100 e DMSO da Sigma-Aldrich foram utilizados. Também foram utilizados iodeto de propídeo e SYBR Gold da Invitrogen, USA.

Obtenção de colágeno de tilápia (O. niloticus)

O colágeno foi obtido pelo método de extração de colágeno solúvel em ácido acético (ASC), segundo relatório recente (9). Após sucessivas lavagens com água destilada em abundância, a pele de tilápia foi pré-tratada com 0,1M NaOH (1:20 p/v) por 24 h, seguido de tratamento com n-butanol a 10% (1:20 p/v) . Foram realizadas dez lavagens com água em abundância, em seguida, a extração foi realizada em ácido acético 0,5M por 48 h. Todo o procedimento foi realizado a 4,0 °C, filtrado com papel filtro (Whatman N° 4) e depois liofilizado.

Teste de allium

Os bulbos de cebola estavam imersos em água, de forma que o disco germinal estivesse totalmente imerso. Quando as raízes atingiram entre 1 e 2 cm de comprimento, o teste foi iniciado. Foram realizados sucessivos testes de n-butanol para determinar a viabilidade e atividade das células. As concentrações utilizadas foram de 10,0; 1,0; 0,5; 0,1; 0,05 e 0,025%. Em seguida, as raízes em crescimento foram expostas às seguintes soluções: n-butanol, água residual da última lavagem do pré-tratamento do processo de extração de colágeno (décima lavagem), colágeno a 0,5% em água destilada e água purificada, como controle. Após 6h de tratamento, os meristemas apicais foram cortados das raízes, fixados em etanol: solução de ácido acético (3: 1 v/v) e mantidos a -4,0 °C por pelo menos 24 h. As amostras foram coradas com 1,0% de orceina acética 1N: HCl (9: 1 v/v) por 30 minutos (21). As amostras foram observadas em um microscópio óptico a 40 e 100X. Foram realizadas três réplicas.

Ensaio do cometa

Foram coletados 10 mL de sangue periférico dos participantes e os glóbulos brancos foram imediatamente isolados e expostos a n-butanol 0,01 e 0,001%; solução de colágeno de tilápia a 0,5%; e controles negativo (PBS) e positivo (12% peróxido de hidrogênio). Após 2h de tratamento, a viabilidade dos glóbulos brancos foi determinada pela coloração com iodeto de propídio de 1,0mM (Invitrogen, EUA) e controlada com um microscópio de fluorescência Olympus BX51 40X, usando filtros de 536 e 617 nm. As amostras foram colocadas em cubas previamente preparadas com primeira camada de agarose e a lise celular foi realizada com o tampão contendo NaCl 2,5M, Na2EDTA 100mM, Tris HCl 10mM, Triton X-100 1% e DMSO 10%. Depois, foram incubadas a 4,0 °C por 4 h e seguidas por eletroforese a 25V (Power Pack P25 Timer, Biometra GmbH, Alemanha) e 300mA por 30 minutos em pH tampão 13 (1,0mM Na2EDTA e 300mM NaOH). Foi realizada a neutralização na solução Tris HCl pH 7,5 por 3 minutos e fixação em 96° álcool por 3 minutos (22). Amostras coradas com SYBR Gold foram observadas em microscópio de fluorescência com ampliação de 40X (23).

Coleta de dados

A frequência das fases do ciclo celular foi registrada e tipificada nos diferentes tratamentos e nos tratamentos que registraram alterações genéticas no ensaio de Allium. O dano de DNA foi quantificado usando o programa Score Assay e a porcentagem de DNA na cauda (% DNA na cauda) foi considerado um parâmetro de genotoxicidade no ensaio do cometa (24).

Análise estatística

As médias de cada variável foram comparadas pela análise de variância com o programa Origin Pro 2020 (OriginLab Corporation, EUA) e a análise de regressão foi aplicada para revelar a relação dose-respostas compostos químicos, com nível de confiabilidade de α = 0,05.

Resultados e Discussão

Os métodos de extração de colágeno são bem descritos na literatura. Em geral, três etapas são comumente usadas para extrair hidrolisados de colágeno de baixo peso molecular de recursos naturais: tratamento inicial da matéria-prima, extração de gelatina (colágeno) e hidrólise de colágeno. Na fase de pré-tratamento (tratamento inicial), hidróxido de sódio é usado para eliminar as proteínas não colágenas e o álcool butílico para reduzir os lipídios. A última etapa pode ser dividida em hidrólise enzimática, química e subcrítica (3).

A dinâmica de proliferação celular no meristema apical de Allium cepa, alcançada entre 1 a 3 dias de indução de crescimento, é um cenário biológico sensível para detectar substâncias que podem afetar o material genético (25). Assim, o teste de Allium é comparável aos ensaios com animais e culturas de linhagens celulares (26). Na Figura 1A observa-se aspecto transparente e raízes muradas, ao contrário das raízes ilustradas nas Figuras 1B e 1C, que corresponderam aos tratamentos com amostras da suspensão do colágeno (0,5%) e o controle, cultivadas em água destilada, respectivamente. A degradação do núcleo e do citoplasma (Figura 1D) das amostras expostas ao n-butanol a 10.0% por 6 h, sendo aquelas concentrações consideradas letais. Além disso, observou-se alta inibição da atividade celular para 1,0% n-butanol, índice mitótico de 2,99% com ausência de células normais na metafase; e o índice mitótico de 2,75% (não significativo) foi encontrado para 0,5% n-butanol com a presença de fases mitóticas. Ainda, havia quatro metafases, duas pró-fases e uma telofase em um campo visual único incomum na concentração de 0,025% (Figura 1E).

A porcentagem de divisões celulares em meristemas radiculares de A. cepa foi determinada pelo índice mitótico. Para 10,0% do n-butanol foram observadas letalidade e ausência de atividade celular, enquanto para 1,0; 0,5; e 0,1% observou-se diminuição significativa na atividade celular em comparação com as de 0,05 e 0,025%. Estes últimos índices foram comparáveis aos do controle negativo, da solução de colágeno em 0,5% e da água residual da lavagem final (a décima) do processo de pré-tratamento (Figura 2).

Observamos as seguintes alterações de nível celular produzidas por n-butanol em A. cepa no nível de metáfase: efeito citostático parcial em concentrações de 0,5 e 1,0%. A Figura 3A ilustra metáfase normal e, a Figura 3B, a metáfase parada (c-metafase), na qual os cromossomos estão dispersos e altamente condensados. Essa variação irregular foi um indicativo da ausência ou falha da formação do eixo acrômico, bem como sinais de compactação cromossômica devido à estagnação metafásica (27). A presença de cromossomos lag em anáfase (Figura 3D) e estrutura multipolar em telófase (Figura 3F), variantes das fases normais de anáfase e telófase bipolar (Figuras 3C e E, respectivamente) são provas que contribuem para a disfunção do fuso acromático e da divisão centrossômica defeituosa, como é ilustrado na Figura 3F com quatro centros polares em vez de dois. A montagem do fuso mitótico organizado de forma bipolar, com equilíbrio dinâmico de cinesina-5 e dineína, garante a distribuição equitativa de cromossomos durante a segregação em mitose (28).

Ademais, a organização disfuncional em centrossomas supranumerários leva a falhas na citocinese e variações numéricas de cromossomos nas células resultantes (29). A Figura 3G-I ilustra que outra alteração produzida pelo n-butanol foi a quebra de cromossomos. A Figura 3G ilustra uma célula em telófase com uma ponte cromossômica; ademais, não está claramente definido se eles estavam atrasados ou se são cromossomos tripolares. Na ausência de citocinese, uma célula tripolar com pontes cromossômicas entre grupos cromossômicos aumentaria para uma célula com três núcleos, na Figura 3H,I. Da mesma forma, a presença de micronúcleos (Figura 3I) foi uma evidência de quebras cromossômicas produzidas em fases anteriores à mitose.

As alterações, após 6h de exposição, foram registradas na fase final do processo de replicação (fase S) e G2 (pré-mitótica), bem como a presença de centros multipolares. Eles podem ocorrer como consequência da instabilidade celular e do citoesqueleto cromossômico devido ao efeito do n-butanol, que teria produzido fragmentação do(s) centrossomo(s) pré-existente(s) em vez de uma amplificação do centrossomo. Já foi observada a formação de fuso multipolar independentemente da amplificação do centrossomo em células HeLa após irradiação na fase G2 (30). Ademais, sabe-se que a duplicação do centrossomo ocorreu apenas uma vez em cada ciclo celular e teve início na fase G1 (pré-replicação)/fase S e concluída durante a fase G2 (31). No entanto, futuras investigações com rotulagem centrosossomal devem ser realizadas para esclarecer se é uma fragmentação ou amplificação.

A Tabela 1 apresenta alterações quantificadas pelo efeito de n-butanol, com as mais frequentes células multipolares, seguidas por metafases com cromossomos dispersos e condensados. Alterações cromossômicas não foram registradas nos outros tratamentos, verificando assim a genotoxicidade do n-butanol.

O ensaio do cometa é um dos métodos utilizados para medir danos ao DNA, utilizando sangue inteiro (22) ou glóbulos brancos isolados diretamente do sangue periférico (5). Entre os parâmetros de genotoxicidade, a porcentagem de DNA no teste do cometa é usada como parâmetro mais informativo devido à sua relação com a magnitude do dano de DNA. Quanto mais o DNA quebrar, maior o comprimento da cauda devido à migração, portanto, a visualização será imediata e a intensidade da cauda mais evidente (32). Os dados de dano ao DNA foram quantificados usando o parâmetro percentual de DNA na cauda.

Em nossa investigação, a toxicidade do n-butanol foi determinada pela porcentagem de células vivas com a coloração diferencial dada pelo iodeto de propídio em glóbulos brancos isolados do sangue periférico humano. Apenas células mortas eram coloridas, como na Figura 4. Concentrações acima de 0,1% de n-butanol foram letais aos glóbulos brancos. O percentual de viabilidade dos glóbulos brancos expostos a 0,001% n-butanol foi de 96,87%. Foi relatado que é necessário que a viabilidade das células seja superior a 75% para a validade dos testes de genotoxicidade (33).

O dano de DNA dos glóbulos brancos foi evidenciado pelo grau de migração de DNA na eletroforese unicelular alcalina (pH> 13) quando exposto ao n-butanol. A heterogeneidade da resposta dos glóbulos brancos a um composto clastogênico foi evidenciada na mesma dose sub-letal e tempo de exposição registrado em todas as investigações (34). A Figura 5 ilustra a magnitude variável dos danos do DNA em glóbulos brancos, a partir do nível zero (sem dano) em A, níveis de dano leve em B e C, dano médio em D e dano elevado em E e F. Esses tipos de danos foram registrados em todos os tratamentos, incluindo os controles positivo e negativo, sendo a % de causa de DNA o parâmetro que usamos para determinar a atividade clastogênica.

A Figura 6A ilustra a comparação das médias do percentual de DNA na cauda do cometa para o tratamento com n-butanol (0,5%), sem diferenças com o controle positivo e significativamente diferente do controle negativo, bem como o extrato de colágeno (0,5%). O percentual de viabilidade avaliado após o tratamento com n-butanol permaneceu acima de 95% com média entre os tratamentos de 97,20 ± 0,12%. Concentrações inferiores a 0,1% do n-butanol apresentaram diminuição do efeito clastogênico, sem variações significativas entre elas (Figura 6B). A alta variabilidade no grau de dano dos glóbulos brancos expostos ao n-butanol dentro de cada tratamento refletiu a variação na sensibilidade da resposta celular.

 

Nos testes citológicos de A. cepa com o líquido de lavagem e com colágeno a 0,5%, o ciclo mitótico foi normal, sem evidência de dano cromossômico. Se os enxágues não fossem suficientes, os resíduos químicos poderiam permanecer no colágeno. Devido ao baixo teor de gordura na pele da tilápia (3,85%) (35), em comparação com outras espécies de peixes, como Sardinella maderensis (26,0%) e S. aurita (24,0%) (36), o n-butanol poderia ser substituído por álcool etílico para remover a gordura (37). Outro tratamento alternativo para eliminar a gordura da matéria-prima é a fermentação com Bacillus velezensis, que tem alta capacidade de metabolizar gordura e proteínas (38).

Foi demonstrado que 1-butanol ou n-butanol é absorvido pela pele e trato respiratório e produz alterações patológicas no fígado e rins em ratos, mas não um efeito mutagênico ou cancerígeno (39). Da mesma forma, investigações em ratas gestantes expostas a 1,0% de n-butanol administrado através da água relataram toxicidade e diminuição do peso corporal materno e fetal (40). Para o teste de Ames, foi relatado efeito não mutagênico para o n-butanol (16). Em contraste, os embriões de peixes-zebra expostos ao n-butanol apresentaram danos oxidativos graves com consequentes danos nos tecidos hepáticos e cerebrais, de acordo com um estudo recente (41). No entanto, nosso estudo revelou a possibilidade da ocorrência em alterações genéticas se o n-butanol for continuamente utilizado por longos períodos de tempo.

Em resumo, revelamos a fragmentação de DNA de células em interfases, especializadas e viáveis expostas in vitro ao n-butanol com o ensaio do cometa. Outras alterações são evidenciadas, além de quebras de DNA com o teste de Allium. No entanto, mais evidências são necessárias para fornecer informações sobre os mecanismos de ação de danos de DNA do n-butanol.

Conclusões

Na avaliação de segurança do extrato de colágeno obtido da pele da tilápia (Oreochromis niloticus) para uso dermocosmético, concluímos que o n-butanol foi um composto genotóxico utilizado no processo, com alterações significativas no aparelho mitotístico e cromossomos de Allium cepa, bem como alta porcentagem de DNA na cauda dos cometas. Ademais, revelamos uma evidência clara para considerar a substituição parcial (do n-butanol) ou verificação de sua eliminação total por lavagens sucessivas para minimizar sua existência remanescente na matéria-prima para preparos adicionais contendo produtos naturais, como o colágeno derivado de fontes sustentáveis. Observamos a importância de fornecer evidências da atividade genotóxica dos produtos químicos utilizados no processo de extração de colágeno para garantir a ausência de possíveis contaminantes químicos nos materiais utilizados para outras formulações dermocosméticas.

Declaração sobre as contribuições do autor

Conceituação, Z.A.P., C.A.-J.; metodologia, L.S.-T., N.R.-P.; análise formal, A.R.B., D.S., C.A.-J., R.F.; investigação, Z.A.P., R.Q.-L., A.R.B., A.L.M.-J., C.A.-J., D.S.; redação - preparação original do rascunho, Z.A.P., A.L.M.-J., F.D.S., A.R.B.; redação e edição, A.R.B., R.M.M., A.L.M.. -J.; supervisão, Z.A.P., C.A.-J.; administração de projetos, Z.A.P., C.A.-J.; aquisição de financiamento, Z.A.P., R.Q.-L., A.R.B. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento

Os autores são muito gratos ao CONCYTEC-FONDECYT, processo E041-01 (Contrato nº 123-2018-FONDECYT-BM-IADT/AV), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Processo 305250/2019-1, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brasil (CAPES) Código Financeiro 001 e Programa Nacional de Pós-Doutorado (PNPD).

Reconhecimento

Os autores são muito gratos a Mónica Arqueros, bióloga, por sua ajuda com o Teste do Cometa.

Conflitos de Interesse

Os autores não declaram conflito de interesses.

Declaração Ética

Esta pesquisa foi desenvolvida no âmbito do Processo Ético N°: 001-2020/CEI-UNT (Universidad de Trujillo).

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