Ciências Biofarmacêuticas, Biomed Biopharm Res., 2021; 18(1):114-122
doi: 10.19277/bbr.18.1.254; download da versão pdf [+] aqui
Avaliação da toxicidade geral de derivados de Roileanonas pelo ensaio de letalidade de Artemia salina
Epole Ntungwe 1,2, Vera M. S. Isca 1,3, Ana María Díaz-Lanza 2, Carlos A. M. Afonso 3, Patrícia Rijo 1,3*
1CBIOS – Center Research for Biosciences & Health Technologies, Lisbon, Portugal; 2Department of Biomedical Sciences, Faculty of Pharmacy, University of Alcalá, Spain; 3iMed.ULisboa, Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, Portugal
*autor correspondente: Este endereço de email está protegido contra piratas. Necessita ativar o JavaScript para o visualizar.
Resumo
O cancro é a segunda principal causa de morte no mundo, A Organização Mundial da Saúde registou cerca de 9,6 milhões de mortes atribuídas ao cancro em 2018. Assim existe uma grande urgência por novos fármacos anticancerígenos. Os produtos naturais continuam a ser uma importante fonte para a identificação e desenvolvimento de novos tratamentos para o cancro. O género Plectranthus engloba espécies de plantas bem conhecidas pelas suas propriedades medicinais e amplamente utilizadas no tratamento de algumas doenças. Estas plantas são ricas em diterpenóides, compostos estes que apresentam diversas atividades farmacológicas interessantes, incluindo efeitos citotóxicos. O camarão marinho (Artemia salina) é amplamente utilizado em estudos de letalidade e é um ponto de partida vantajoso para a pesquisa de toxicidade geral de produtos naturais. Este ensaio é baseado na capacidade que os produtos naturais apresentam para matar náuplios criados em laboratório. Neste trabalho relatamos a toxicidade geral de alguns derivados preparados a partir dos compostos 6,7-dehidroroileanona (1) e 7α-acetoxi-6β-hidroxiroileanona (2). O bioensaio de A. salina é um teste simples, rápido e de baixo custo, muito útil para a avaliação preliminar da toxicidade geral de produtos naturais, orientando assim para possíveis atividades biológicas.
Palavras-chave: Artemia salina, toxicidade geral, Roileanonas, Plectranthus
Recebido: 23/02/2021; Aceite: 20/04/2021
Introdução
Durante as últimas três décadas, houve um progresso significativo na compreensão e tratamento do cancro. No entanto, o cancro continua a ser a segunda causa de morte por doenças não transmissíveis no mundo. Em 2018, havia mais de 18 milhões de novos casos de cancro e aproximadamente 10 milhões de pessoas morreram da doença, em todo o mundo (1,2).
As plantas medicinais são importantes fontes de obtenção no desenvolvimento de novos medicamentos e produtos. Os produtos naturais desempenham um papel relevante no tratamento do cancro, com um número substancial de agentes anticancerígenos, de uso clínico atual, provenientes de origem natural ou derivados de produtos naturais, de várias fontes, como plantas, animais e microrganismos (também de origem marinha) (3,4). Durante as últimas décadas, uma vasta gama de agentes citotóxicos foi descoberta em plantas, alguns dos quais são utilizados atualmente no tratamento do cancro. O paclitaxel (Taxol), por exemplo, obtido a partir da casca de Taxus brevifolia, é um dos quimioterápicos mais conhecidos de origem natural em quimioterapia e dos mais ativos (5).
Artemia salina, popularmente conhecido como artémia, é um minúsculo invertebrado halófilo pertencente ao Filo Arthropoda e Subfilo Crustáceo, que desempenha um papel importante nos ecossistemas salinos aquáticos. Além do seu uso como alimento na aquicultura, também é altamente valorizado pelo seu uso de larvas na avaliação da toxicidade geral (6). O uso de A. salina ganhou enfase em estudos de triagem de toxicidade, de curto prazo. Isso deve-se à sua facilidade de cultura, curto tempo de geração e distribuição cosmopolita (7). Além disso, os ovos de artémia permanecem viáveis por muitos anos e são, portanto, uma fonte biológica adequada (8). Outras vantagens do uso de artémia em testes de toxicidade incluem: (i) rapidez (ou seja, 28-72 h desde a eclosão do ovo até o primeiro ponto final); (ii) custo-benefício; (iii) a disponibilidade de náuplios nascidos de cistos duráveis comerciais (ovos) (ou seja, homogeneidade da população e disponibilidade durante todo o ano, sem a necessidade de cultivo) (9). O seu uso como organismo-teste é baseado em mecanismos celulares que podem ocorrer via necrose, caracterizada pela perda da integridade da membrana, morte celular ou apoptose, programa genético de morte celular controlada (10). O National Cancer Institute (NCI, EUA) evidenciou uma correlação significativa entre o ensaio de artémia e a inibição do crescimento in vitro de linhas de células tumorais sólidas humanas, o que apoia fortemente o uso do modelo de A. salina em testes de toxicidade geral (11–14). Isso é significativo porque mostra o valor deste bioensaio como uma ferramenta de pré-triagem para a pesquisa de fármacos antitumorais (15–18). No presente estudo, a toxicidade geral de dezassete derivados obtidos a partir de 6,7-dehidroroileanona (1) e de 7α-acetoxi-6β-hidroxiroileanona (2) foi avaliada no ensaio de letalidade de A. salina.
Materiais e Metodos
Material vegetal
As plantas P. madagascarensis Benth e P. grandidentatus Gürke foram cultivadas no Parque Botânico da Tapada da Ajuda (Instituto Superior Agrário, Lisbon, Portugal) a partir de estacas obtidas do Kirstenbosch National Botanical Garden (Cidade do Cabo, África do Sul). Os processos de isolamento e extração dos produtos naturais 1 e 2 (Figura 1) foram realizados segundo Garcia C. et al., 2018 (19) e Bernardes C.E.S. et al, 2018 (20), respetivamente.
Procedimentos das Reações
As reações e a purificação, identificação e estabilidade dos derivados de roileanona foram realizadas no estudo de Garcia et al. 2020 (21), Esquemas 1 e 2.
Avaliação da toxicidade geral – Bioensaio de letalidade de Artémia
As amostras analisadas foram preparadas a uma concentração de 100 ppm, em meio salino (Sal para camarão marinho adquirido a JBL GmbH and Co. KG, D-67141 Neuhofen, Alemanha) à concentração de 35g/L. Numa placa de 24 poços, colocaram-se aproximadamente 10 a 15 larvas, em meio salino, em cada poço. De seguida, cada composto foi adicionado (100 µL) ao poço correspondente e a placa armazenada por 24h a 25ºC. Após 24h, o número de larvas mortas em cada poço foi registado. De modo a determinar o número total de larvas em cada poço, a morte das larvas vivas remanescentes foi induzida, pela adição de dicromato de potássio (K2Cr2O7) a 1 mg / mL.
Após 24h, todas as larvas mortas foram contadas e a taxa de mortalidade (%) determinada de acordo com a Equação 1. O controlo negativo utilizado foi o dimetilssulfóxido (DMSO), na mesma concentração das amostras (100 ppm). Quatro réplicas foram usadas para cada teste, e o ensaio foi realizado em triplicado.
Análise Estatística
Os resultados foram expressos como valores médios ± desvios padrão. As comparações foram realizadas dentro dos grupos pela análise de variância, utilizando o teste ANOVA. As diferenças significativas entre os grupos controlo e experimental foram avaliadas pelo software SigmaStat (StatSoft, Tulsa, OK, EUA). O nível de significância p <0,05 foi considerado para indicar significância estatística.
Resultados e discussão
Hemi-síntese de derivado de royleanone
Diversas reações hemi-sintéticas foram realizadas com o objetivo de preparar uma pequena biblioteca de compostos com elevado potencial citotóxico. Os compostos naturais 1 e 2 (Figura 1) foram submetidos a reações de Mitsunobu, assistidas por micro-ondas, e de benzoilação. Reações de carbamoilação, tosilação, metilação e introdução dos grupos Boc (terc-butiloxicarbonil) e TBDPS (terc-butildifenilsilil) também foram testadas no composto 2. As estruturas previstas e os derivados isolados (3 a 20) estão apresentados nos Esquemas 1 e 2.
As reações de introdução do grupo Boc (17), metilação (18) e benzoilação (19 e 20) originaram produtos puros com bons rendimentos gerais (97% para o derivado 17, 28% para o derivado metilado 18 e 50% e 69% para os benzoilados 19 e 20, respetivamente), Esquema 2. Infelizmente, os produtos 3 a 16 (Esquema 1) apresentaram uma elevada taxa de decomposição, ocorrendo especialmente após o isolamento.
Avaliação da toxicidade geral através do ensaio de letalidade de A. salina
Alguns dos derivados esperados não se formaram devido à sua instabilidade química. No entanto, avaliou-se a toxicidade geral de todos os derivados obtidos. A toxicidade geral foi avaliada através do bioensaio de letalidade de artémia. A Figura 2 ilustra a taxa de mortalidade (%) de A. salina após 24 h de exposição aos diterpenóides.
De acordo com os resultados apresentados, o produto natural 1 apresenta uma atividade tóxica moderada (36.68% à concentração de 100 ppm). O derivado tosilado instável (9) é responsável pela taxa de mortalidade mais elevada do ensaio (81.87%).
De um modo geral, as modificações induzidas na estrutura do composto natural 1, por reações de Mitsunobu assistidas por micro-ondas, conduziram a um aumento da toxicidade em todos os derivados (3 to 5). Do mesmo modo, os derivados estáveis 18 (metilado) e 19 (benzoilado) aumentaram a toxicidade verificada no composto de partida (1). Os derivados 9 - 11, 10 e 11 apresentaram a menor taxa de mortalidade.
A roileanona natural 2 apresenta valores de toxicidade ligeiramente inferiores a 1 (30.95% à concentração de100 ppm). À semelhança do que se verificou com 1, os derivados de Mitsunobu (compostos 6 a 8) obtidos a partir de 2 foram responsáveis por um aumento da toxicidade comparativamente com ao composto de partida. Adicionalmente, o produto benzoilado de 2 (composto 20) aumentou ligeiramente a toxicidade verificada em 2.
Considerando que apenas os derivados 17 a 20 são estáveis, o derivado 18 foi obtido com baixo rendimento e o 17 apresentou baixa toxicidade, os resultados demonstram que os compostos 19 e 20 (ambos ésteres) são os mais promissores.
Conclusões
A reatividade de duas roileanonas naturais 1 e 2 foi estudada através de várias reações hemi-sintéticas. Os produtos obtidos apresentaram alguns problemas de estabilidade: os derivados 3 a 16 degradaram no processo de isolamento. No entanto foram obtidos produtos puros e estáveis, com bons rendimentos globais, nas reações de metilação, benzoilação e introdução do grupo BOC (17 a 20).
A toxicidade geral através do modelo de A. salina foi avaliada para os derivados preparados. Os derivados 3 a 8, 14 e 18 a 20 aumentaram a toxicidade do composto natural de partida. Os produtos 19 e 20 apresentaram os melhores resultados quanto à estabilidade e elevada toxicidade, sugerindo que a formação de ésteres é uma abordagem mais conveniente para futuros derivados.
Declaração Sobre as Contribuições do Autor
EN, VI - experimental e escrita original; AD - visualisação; CA - metodologia, supervisão; PR - concepção, supervisão, edição final
Financiamento
Os autores agradecem à FCT pelo apoio financeiro para este trabalho através dos projetos UIDP/04567/2020 e UIDB/04567/2020 e bolsa de Doutoramento SFRH/BD/137671/2018.
Conflito de Interesses
Os autores não têm conflitos de interesse a reportar.
Referências
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