Ciências Biomédicas, Biomed Biopharm Res., 2022; 19(2):278-298
doi: 10.19277/bbr.19.2.294; versão pdf aqui [+]; versão inglês html [EN]
Suplementação de farinha de folhas de Moringa oleifera previne distúrbios metabólicos induzidos pela frutose em ratos jovens
Izabel Carolina Bousfield Terranova 1, Izabelle Coelho Souza 2, Isadora Simas Ribeiro 2, Milena Fronza Broering 1, Aline De Faveri 1, Marina Jagielski Goss 1, Ana Mara de Oliveira Silva 3, Rivaldo Niero 1, Eduardo Augusto Steffens 1, Larissa Benvenutti 1, Luciano Vitali 4, Samantha Gonçalves 4, Isabel Daufenback Machado 5, Nara Lins Meira Quintão 1, José Roberto Santin 1*
1Postgraduate Program in Pharmaceutical Science, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, SC, Brazil; 2School of Heath Sciences, Nutrition Course, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, SC, Brazil.; 3Nutrition Department (DNUT), Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, SE, Brazil; 4Department of Chemistry, Federal University of Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brazil; 5Postgraduate Program in Biodiversity, Fundação Universidade Regional de Blumenau, Blumenau, SC, Brazil
autor para correspondência: Este endereço de email está protegido contra piratas. Necessita ativar o JavaScript para o visualizar.
Resumo
A farinha de folhas de Moringa oleifera é amplamente utilizada para tratar condições metabólicas. O objetivo foi avaliar o efeito da farinha de M. oleifera (MOF) sobre as alterações metabólicas induzidas pela frutose. Os compostos fenólicos foram determinados por LC-ESI-MS/MS. Ratos Wistar foram distribuídos em grupos: 1) Controle (ração normal + água); 2) Frutose (ração normal + frutose (20%) em água) e 3) Alimentação com MOF20% + frutose (20%) em água. Ao final da 4ª semana de tratamento, os animais foram submetidos ao teste de resistência à insulina (RI), coleta de sangue e avaliação histológica. MOF possui compostos fenólicos como quercetina e ácido clorogênico. A suplementação com MOF promove redução na glicemia, insulina, triglicerídeos. A suplementação melhorou a sensibilidade à insulina. Na análise histológica, a suplementação com MOF reduziu a hipertrofia dos adipócitos e a deposição de lipídios no fígado. Os dados obtidos mostraram que a suplementação com MOF apresentou efeito protetor contra as consequências nocivas do consumo excessivo de frutose.
Palavras-chave: Moringa oleifera, síndrome metabólica, diabetes, frutose, ratos
Recebido: 24/08/2022; Aceite: 21/11/2022
Introdução
A frutose é um tipo comum de açúcar na dieta americana. Uma das principais fontes de frutose é o xarope de milho rico em frutose (HFCS), um substituto barato para o açúcar de cana que foi introduzido na década de 1970. Agora é usado para adoçar uma variedade de alimentos, incluindo refrigerantes, doces, assados e cereais. Estudos associaram o consumo excessivo de HFCS e outros açúcares adicionados a resistência à insulina, anormalidades lipídicas, obesidade, hipertensão e disfunção renal (1,2). A alta ingestão de frutose foi associada a elevação da pressão arterial e concentrações de ácido úrico entre adultos nos Estados Unidos sem histórico de hipertensão. Além disso, a mesma prevalência de doença metabólica tem sido observada na população mais jovem, bem como em crianças (2).
A frutose é metabolizada principalmente nos hepatócitos pela frutosequinase que fosforila rapidamente a frutose para gerar frutose-1-fosfato (2). A via do metabolismo consiste em várias outras etapas e os resultados são metabólitos primários e produtos secundários, incluindo glicose, lactato, ácidos graxos livres, lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) e ácido úrico (3) .
Moringa oleífera Lam. é uma espécie pertencente à família Moringaceae, comumente conhecida como Moringa. A farinha produzida a partir de suas folhas é amplamente utilizada na medicina popular para tratar diabetes e outras doenças metabólicas. De fato, as folhas da Moringa são a parte mais utilizada da planta, que apresenta um grande número de compostos bioativos, principalmente compostos fenólicos, como quercetina, ácido clorogênico e ácido cafeico (4).
M. oleifera tem sido extensivamente estudada in vivo em várias condições, pois pode fornecer efeito hepatoprotetor (5), hipoglicêmico (6,7,8), protetor contra doenças metabólicas induzidas por dieta (9), anti-obesidade e efeito antioxidante in vitro (10).
Flavonoides e saponinas presentes na planta são relatados para aumentar o HDL (lipoproteína de alta densidade) e reduzir o colesterol total, LDL (lipoproteína de baixa densidade) e colesterol VLDL (lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL) (11). Os ácidos fenólicos, incluindo o ácido clorogênico (CGA) identificado nas folhas de M. oleifera (12), demonstrou apresentar propriedades antioxidantes e anti-hiperglicêmicas (13–15).
Considerando o aumento da prevalência de disfunção metabólica induzida pela dieta pelo consumo de frutose, este estudo foi desenhado para investigar os compostos fenólicos na farinha de folhas de M. oleifera (MOF) e os efeitos protetores da suplementação oral de MOF nas alterações metabólicas iniciais induzidas pelo consumo de frutose em ratos jovens.
Material e Métodos
Amostras
A farinha de M. oleífera (MOF) obtida a partir das folhas foi adquirida de uma indústria em São Paulo, SP, Brasil (número de registro 0111.0820.08R-1). A farinha foi mantida na geladeira em frascos escuros hermeticamente fechados a 4°C durante todo o período do experimento. Para obtenção do extrato, a farinha (200 g) foi submetida à maceração estática em metanol por 7 dias e depois utilizada para análise fitoquimica.
Identificação de compostos fenólicos por LC-ESI-MS/MS
A análise foi realizada em um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (Agilent Technologies, Alemanha) e uma coluna Phenomenex® Synergi 4 μ Polar-RP 80A (150 mm x 2 mm ID, tamanho de partícula de 4,6 μm) à temperatura de 30ºC. A fase móvel utilizada foi composta por solvente A (95% metanol em água) e solvente B (0,1% ácido fórmico em água). As separações foram realizadas usando gradiente de eluição segmentado como segue: 0-5 min, 10% A; 5–7 min, 90% A; 7–10 min, 90% A; 10–17 min, 10% A. A taxa de fluxo e o volume de injeção da amostra foram 250 μL/min e 10 μL, respectivamente. O sistema LC foi acoplado a um sistema de espectrometria de massa composto por um espectrômetro de massa híbrido triplo quadrupolo/linear ion trap Qtrap® 3200 (Applied Biosystems/MDS SCIEX, Waltham, MA, EUA) com Turbo Ion Spray® como fonte de ionização, no modo de ionização negativa. Os parâmetros MS/MS utilizados foram quadrupolo de interface de spray iônico a 400°C; tensão de -4500 V; gás de cortina, 10 psi; gás nebulizador, 45 psi; gás auxiliar, 45 psi; gás de colisão, médio. O modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) foi usado na análise. Para a identificação dos compostos fenólicos, quarenta e cinco padrões foram dissolvidos em metanol e analisados nas mesmas condições descritas acima. O software Analyst® (versão 1.5.1) foi utilizado para registrar e processar os dados.
Atividade antioxidante
A determinação do potencial redutor do extrato de MOF foi realizada pelo ensaio de poder redutor/antioxidante férrico (FRAP). Resumidamente, em um poço de microplaca, 9 μL de extrato em concentrações de 3, 10, 30, 100, 300 e 1000 μg/mL ou ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (Trolox) (100 μg/mL) foram adicionados a 27 μL de água destilada e 270 μL de solução FRAP recém-preparada (tampão acetato pH 3,6 (0,3 mmol/L), 2,4,6-tripiridil-s-triazina (10 mmol/L) e férrico (FeCl3). A mistura de reação foi incubada a 37 °C por 30 min. Em seguida, a absorbância foi medida a 595 nm. Uma curva padrão para FeSO4 foi plotada e usada para calcular o poder redutor do extrato.
A capacidade antioxidante foi avaliada contra o modelo do 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). Resumidamente, uma mistura de reação contendo 50 μL de extrato de MOF a 10, 30, 100, 300 e 1000 μg/mL ou Trolox (100 μg/mL) adicionado com 150 μL de solução estoque DPPH (24 μg/mL) foi incubada à temperatura ambiente no escuro por 30 min e ler a 517 nm. Todas as determinações foram acompanhadas por um controle (em branco) sem as amostras de antioxidantes. A diminuição dos valores de absorbância das amostras foi correlacionada com o controle e a porcentagem de eliminação do radical DPPH foi expressa pela equação: % de eliminação = ((Abscontrol – Abssample)/Abscontrol) x 100. Os resultados foram expressos como porcentagem de atividade de eliminação de DPPH
Animais e tratamento
Ratos Wistar machos, com 21 dias de idade, foram obtidos do biotério da Universidade do Vale do Itajaí. Os animais tiveram livre acesso a água e comida. Os ratos foram alojados em três animais por gaiola e aclimatados às condições de laboratório (20-23 ºC, umidade 60%, ciclo claro/escuro de 12 h) por pelo menos uma semana antes de cada estudo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes da Sociedade Brasileira de Ciências de Animais de Laboratório para o cuidado e uso adequado de animais de experimentação. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética local da Universidade do Vale do Itajaí, Brasil (protocolo nº 017/17).
Todos os ratos foram pesados e o consumo de água e ração foi quantificado a cada dois dias. A frutose foi fornecida na água na concentração de 20%. Vinte e sete ratos foram distribuídos em diferentes grupos (n=9): (1) controle: água e ração padrão; (2) água com solução de frutose a 20% (p/v, preparada a cada dois dias) e ração normal; (3) água com solução de frutose a 20% e ração padrão suplementada com 20% de MOF por 4 semanas. A metodologia referente à quantidade de farinha de M. oleifera adicionada à ração foi baseada em trabalho anterior com farinha de produtos vegetais (16,17), e a quantidade de frutose suplementada em água foi proposta por Mamikutty et al. (2014) (18).
Circunferência abdominal
No início do experimento e no final da 4ª semana foi medida a circunferência abdominal dos animais. A medida foi realizada com o animal em decúbito ventral com fita métrica na região correspondente à linha acima da crista ilíaca. Para acessar o percentual de aumento do ganho de circunferência abdominal, considerou-se a medida inicial e final.
Teste de resistência a insulina (TRI)
O TRI foi realizado por um método previamente descrito para ratos (19) O alimento foi retirado às 08h00 no dia do estudo, e o procedimento foi iniciado às 13h00. A insulina humana (Humulin®) foi administrada por via intraperitoneal em ratos na dose de 0,75 U/kg de peso corporal. O sangue da cauda foi coletado em 0 (antes da infusão de insulina), 30, 60, 90 e 120 min (pós infusão). Os níveis de glicose no sangue foram medidos com um glicosímetro (Accu-chek® Active, Roche Diagnosis, Basel, Suíça) em cada ponto de tempo. A área sob a curva de decaimento da glicose (AUC) foi calculada para cada camundongo e a média foi calculada para cada grupo (20).
Parâmetros bioquímicos
A análise bioquímica foi realizada com as amostras de sangue coletadas ao final do experimento. Após o protocolo de jejum, os animais foram anestesiados (cetamina e xilazina) e suas amostras de sangue foram retiradas da artéria braquial. As amostras foram centrifugadas a 4.000 g, a 4 °C por 10 min para separação do soro. As concentrações de colesterol total (CT), lipoproteína de alta densidade-colesterol (HDL-c), colesterol sem HDL, triglicerídeos, glicose e a atividade da aspartato transaminase (AST), alanina transaminase (ALT) e fosfatase alcalina (ALP) foram medida usando kits comerciais correspondentes (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil) por espectrofotometria e a concentração sérica de insulina foi medida por ensaio de eletroquimioluminescência.
Análise histológica
Pequenas amostras de tecidos hepático, pancreático e adiposo, extraídas ao final do experimento, foram fixadas em formol a 10%. Em seguida, seguindo o protocolo de desidratação, foram incluídos em parafina, fatiados e corados com hematoxilina-eosina (HE). As imagens dos cortes histológicos foram obtidas usando um microscópio óptico (Olympus CBA, Bartlett, TN, EUA). Para análise do pâncreas, foram capturadas 15 imagens de cada animal em cada grupo experimental usando uma objetiva de 10x. A análise das imagens foi determinada pelo software Image J, que quantificou as áreas das respectivas unidades funcionais de cada tecido. Os resultados foram expressos em µm/campo. Para o tecido adiposo, 10 imagens de cada animal em cada grupo experimental foram capturadas com objetiva de 10x, e as imagens foram analisadas com Adiposoft. Software (CIMA/Universidade de Navarra, Espanha) (21).
Extração de lipídeos hepáticos
O colesterol e os triglicerídeos do fígado foram extraídos de acordo com o método de Folch (1957) (22). No final do experimento, fígados frescos foram extraídos e homogeneizados usando clorofórmio/metanol (2:1, 3,75 mL). Clorofórmio e água destilada foram então adicionados ao homogenato e a solução foi agitada em vórtex. Após centrifugação (1500 g por 10 min), a fase orgânica inferior foi transferida para um novo tubo de vidro e liofilizada. O pó liofilizado foi dissolvido em uma mistura de clorofórmio:metanol (1:2) e então armazenado a -20°C. As concentrações de colesterol e triglicerídeos foram determinadas por meio de kits comerciais de diagnóstico (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil) por espectrofotometria.
Determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no fígado
A avaliação da peroxidação lipídica foi determinada pela concentração de malondialdeído no tecido hepático. A quantidade de TBARS presentes foi determinada conforme descrito por Uchiyama e Mihara (1978) (23). Os fígados foram removidos e homogeneizados a 10% foram preparados em solução de KCl a 15%. A 0,5 mL de homogeneizado a 10% foram adicionados 3,0 mL de H3PO4 a 1% e 1 mL de solução de ácido tiobarbitúrico a 0,6%. Cada mistura foi aquecida por 45 min, resfriada e extraída com n-butanol e a absorbância da cor a 535 nm foi medida. Os resultados foram expressos em nmol de MDA/mg de tecido.
Análise estatística
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão médio (SEM) de 9 ratos por grupo (n=9). Para a análise de evolução do peso e testes de resistência a insulina, foi utilizada ANOVA de duas vias seguida do pós-teste de Bonferroni. Todas as outras comparações estatísticas foram realizadas por meio de análise de variância de uma via (ANOVA), seguidas do pós-teste de Tukey. Todas as análises foram realizadas no programa GraphPad PRISM 6® (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).
Resultados
Caracterização do extrato de MOF por determinação do teor de fenol total e análise LC-ESI-MS/MS
O teor total de fenol no extrato de MOF foi de 122,96 ± 0,18 mg de equivalente de ácido gálico (GAE) por grama de extrato, apresentando 2,27 ± 0,33 g EAG/100 g MOF. O perfil fitoquímico do MOF apresentou diversos compostos, dos quais foi possível identificar sete compostos (Figura 1 e Tabela 1). Os sete principais compostos fenólicos detectados foram identificados como: (1) Ácido protocatecuico; (2) ácido clorogénico; (3) ácido cafeico; (4) ácido p-cumárico; (5) rutina; (6) quercetina; (7) eriodictiol. As concentrações desses compostos foram determinadas e estão apresentadas na Tabela 1. Dentre os compostos identificados, o composto majoritário do extrato é o composto 6, identificado como quercetina com 103,01 mg/g, seguido de ácido protocatecuico e clorogênico com 4,03 e 1,03 mg/g, respectivamente.
Atividade antioxidante in vitro do extrato metanólico MOF
O extrato foi avaliado quanto à atividade antioxidante in vitro pelo ensaio do radical DPPH e pelo ensaio do poder antioxidante redutor férrico (FRAP). A Figura 2A mostra que o extrato metanólico MOF diminuiu significativamente o radical DPPH de 300 –1000 μg/mL. Trolox (100 μg/mL) também reduziu significativamente o radical DPPH em comparação com o sistema. Os dados apresentados na Figura 2B demonstram que o extrato metanólico MOF aumentou significativamente o potencial redutor de 300–1000 μg/mL, quando comparado com o sistema. Trolox (100 μg/mL) também apresentou essa atividade (p<0,001). Em conjunto, os dados mostram que o extrato de MOF possui atividade antioxidante, provavelmente devido à presença de compostos fenólicos na planta.
Efeito do MOF no ganho de peso e medida da circunferência abdominal
A Figura 3 demonstra que a suplementação com MOF e frutose não interferiu no ganho de peso após 4 semanas de intervenção (Figura 3A e 3B). Além disso, também não houve diferença na medida da circunferência abdominal (Figura 3C).
Efeito do MOF na sensibilidade à insulina e à glicose, glicemia de jejum e parâmetros do pancreas
Os resultados obtidos mostraram que ratos suplementados com frutose por quatro semanas desenvolveram resistência à insulina (Figura 4A e 4B) com aumento da glicemia em jejum (Figura 4C). Corroborando com esses dados, os animais também apresentaram aumento do nível de insulina (Figura 4D) e hipertrofia das ilhotas de Langerhans (Figura 4F), o que foi confirmado pela medida da área das ilhotas de Langerhans (Figura 4E). Por outro lado, os animais que receberam suplementação com MOF apresentaram redução nos níveis de glicose, sem outra alteração metabólica correlacionada ao metabolismo da insulina (Figura 4A, 4B e 4D). De fato, a avaliação histológica do pâncreas em animais tratados com MOF foi muito semelhante aos animais do grupo controle (Figura 4F). Além disso, neste grupo, as ilhotas de Langerhans mantiveram o volume celular próximo da normalidade (Figura 4E e F).
Efeito do MOF no perfil lipídico sérico
O efeito da suplementação de MOF no perfil lipídico sérico é demonstrado na Figura 5. A concentração de triglicerídeos (TGL) foi significativamente diminuída (p <0,05) (Figura 5A), enquanto a concentração de colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C) aumentou significativamente em comparação com grupo frutose (p<0,01) (Figura 5C). O grupo frutose apresentou diminuição dos valores de HDL, como esperado, e teve aumento considerável de TGL quando comparado aos dois grupos (Figura 5A). Os valores de colesterol total e colesterol não HDL não mostraram diferenças entre os grupos (Figuras 5B e 5D respectivamente).
Caracterização dos lipídios do tecido hepático
Os dados apresentados na Figura 6 mostram o perfil lipídico hepático após o período de quatro semanas de intervenção. A análise histológica dos hepatócitos corados por H.E. (ampliação x 400) demonstrou menor deposição de lipídios no tecido hepático em animais que receberam suplementação de MOF (Figura 6A). O fígado do grupo tratado com frutose, os hepatócitos, apresentou placas separadas por sinusóides sanguíneos irregulares. As áreas foram caracterizadas como manifestação histológica de lipídios intracitoplasmáticos, próximo à veia lobular central (Figura 6A). A suplementação com MOF foi capaz de prevenir o efeito da frutose no armazenamento de lipídios hepáticos e não foram encontradas anormalidades. De fato, a análise bioquímica demonstrou que a suplementação com MOF preveniu o aumento das concentrações hepáticas de colesterol e TGL (Figuras 6B e C).
Além disso, a peroxidação lipídica foi avaliada de acordo com métodos apropriados através da dosagem de malondialdeído (MDA). Como esperado, amostras de tecido hepático de ratos que consumiram apenas frutose revelaram aumento no MDA em comparação com os outros dois grupos. Além disso, a adição de MOF melhorou o estresse oxidativo, reduzindo a formação de MDA hepático (Figura 6D).
Efeito do MOF nos parâmetros do tecido adipose
Os dados apresentados na Figura 7 mostram que o grupo Frutose apresentou aumento no peso absoluto do tecido adiposo visceral e epididimal (Figuras 7A e 7D) após 4 semanas de tratamento. No entanto, não foi observada diferença significativa entre o peso relativo para ambos os tecidos (Figuras 7B e 7E). Destaca-se que a histologia (Figura 7C) e morfometria (Figura 7F) do tecido adiposo do epidídimo mostraram que a frutose induz maior volume celular nos adipócitos. No entanto, os animais tratados com MOF exibiram tamanho de área celular semelhante ao grupo controle.
Discussão
A M. oleifera é uma planta comestível e contém não apenas nutrientes, mas também compostos bioativos como alcalóides, esteróis, glucosinolatos, isotiocianatos, glicosídeos fenólicos e flavonóides (24,25). De fato, nossos resultados mostraram que o extrato de MOF é rico em compostos fenólicos, conforme previamente publicado (26). Para identificar os diferentes compostos ativos do extrato de MOF, utilizou-se a análise do perfil LC-ESI-MS/MS. A detecção de quercetina, como composto majoritário, seguida de protocatecuico, ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido p-cumárico, rutina e eriodictiol no MOF concorda com estudos anteriores (27).
Os antioxidantes não são apenas agentes redutores que inibem a oxidação de outras moléculas, usados na prevenção, mas também podem tratar complicações de saúde, como condições metabólicas causadas pelo estresse oxidativo (3).A análise fitoquímica do MOF demonstrou a presença de compostos fenólicos e flavonóides, que são antioxidantes eficientes (28). Nesse contexto, a presença e sinergia desses compostos no MOF explica as eficientes propriedades antioxidantes in vitro e in vivo.
Vários pesquisadores apontaram que o consumo excessivo de frutose pode levar a distúrbios metabólicos, especialmente relacionados ao metabolismo da insulina e à síndrome metabólica (29,30). De fato, nossos dados demonstram que a adição de 20% de frutose na água fornecida aos animais por quatro semanas promove alterações metabólicas, principalmente relacionadas à resistência à insulina e acúmulo de lipídios no fígado, sem promover alterações no ganho de peso, circunferência abdominal e deposição de gordura visceral abdominal. Além disso, os dados obtidos na análise histológica do tecido adiposo mostraram que a área do adipócito aumentou nos animais tratados com frutose. Esses dados corroboram com a literatura, que mostra que o consumo de frutose está associado à hipertrofia de adipócitos (31). Em contrapartida, o grupo que teve MOF incorporado à dieta preveniu a hipertrofia de adipócitos quando comparado aos animais tratados com frutose. Esses achados são consistentes com dados anteriores que relataram que o tratamento com M. oleifera regulou negativamente a expressão de mRNA de leptina e resistina e a expressão de mRNA de adiponectina regulada positivamente em tecido visceral de ratos obesos, atenuando a síndrome metabólica (32).
Dos achados acima, a resistência à insulina foi observada em animais que receberam frutose. A resistência à insulina é um aspecto fundamental da etiologia do diabetes tipo 2 e desempenha papel importante não apenas no desenvolvimento da hiperglicemia do diabetes não insulino-dependente, mas também na patogênese de complicações a longo prazo, como hipertensão, nefropatia e hiperlipidemia. O alto consumo de maiores quantidades de frutose facilita a produção de triacilglicerol hepático, em um processo chamado de lipogênese de novo. Esse processo leva a uma “resistência seletiva à insulina”, na qual o metabolismo da glicose inibida pelas vias de sinalização da insulina é prejudicado enquanto aquelas que estimulam o metabolismo lipídico são preservadas, resultando na coexistência devastadora de hiperglicemia e hipertrigliceridemia (33,34).
Corroborando, nossos resultados mostram que o consumo de frutose promove níveis elevados de triglicerídeos e insulina, aumenta a área das ilhotas de Langerhans, altera o comportamento glicêmico em resposta à administração de insulina exógena e hiperglicemia de jejum, caminhando para o comprometimento da cascata de sinalização da insulina. Em contrapartida, os ratos que receberam MOF incorporado à dieta apresentaram triglicerídeos normalizados, metabolismo da glicose e área normal das ilhotas de Langerhans na análise histopatológica. É consistente com estudos recentes que demonstraram o papel das folhas de M. oleifera na modulação de genes-chave hepáticos da sinalização da insulina, reduzindo a hiperglicemia minimizando a gliconeogênese, regulando positivamente a expressão de IR e IRS-1 hepáticos, auxiliando na regeneração de células danificadas. hepatócitos e células pancreáticas em ratos (35,36). Esse efeito pode estar em parte relacionado à presença de ácido clorogênico que aumenta a atividade da insulina ao desencadear a proteína quinase ativada por AMP (AMPK) e por flavonóides que podem promover a estimulação da captação de glicose nos tecidos periféricos (37)
Conforme citado anteriormente, a análise histológica do fígado demonstra que a frutose promove acúmulo de triglicerídeos e colesterol. Esse efeito foi relatado anteriormente por outros estudos (38,39). No entanto, curiosamente, o acúmulo de triglicerídeos no fígado de ratos tratados com frutose ocorreu na ausência de maior peso corporal ou adiposidade. De acordo com Fabbrini et al. (2009) (40), o conteúdo lipídico intra-hepático é um melhor preditor de anormalidades metabólicas do que a adiposidade corporal. A deposição lipídica ectópica induzida pela frutose é atribuída à ativação do fator de transcrição ChREBP e SREBP1c, que ocorre durante o metabolismo da frutose, e esses fatores de transcrição regulam a expressão de várias enzimas responsáveis pela síntese de ácidos graxos (41). Acredita-se que a elevação dos níveis hepáticos de diacilglicerol (DAG) leve à ativação da proteína quinase C (PKC) e sua consequente translocação para a membrana celular, o que resulta na inibição da sinalização hepática da insulina e no desenvolvimento de resistência hepática à insulina.
Em contraste, a suplementação da dieta com MOF foi capaz de prevenir o efeito da frutose nos estoques de lipídios hepáticos, provavelmente devido aos seus compostos bioativos, como a quercetina, que demonstraram alterar a expressão gênica dos principais reguladores da síntese e captação hepática de colesterol e triglicerídeos. O acúmulo de lipídios no fígado sobrecarrega a cadeia mitocondrial de transporte de elétrons, o que, por sua vez, leva ao aumento de EROs e produtos da peroxidação lipídica. O aumento desses mediadores prejudica a função mitocondrial e reduz a β-oxidação lipídica, promovendo ainda maior deposição hepática de lipídios a partir desse ciclo vicioso, criando um estado de estresse oxidativo como resultado da produção de radicais livres (42). Nossos resultados mostraram uma elevação do MDA hepático, um importante biomarcador da peroxidação lipídica, e um comprometimento do sistema de defesa antioxidante. Como esperado, a suplementação de MOF induziu níveis mais baixos de MDA hepático, sendo ele próprio um antioxidante chave no centro de inúmeras reações.
Sendo a quercetina o principal composto do MOF, é importante mencionar que, de acordo com dados da literatura, apenas 5,3% da quercetina inalterada é biodisponível. A quercetina é ingerida na forma de glicosídeos e os grupos glicosil são liberados durante a mastigação, digestão e absorção. Posteriormente, os glicosídeos de quercetina são convertidos em aglicona no intestino antes de serem absorvidos pelos enterócitos pela ação das enzimas glicosidases. Além disso, estudos mais recentes demonstram que os produtos de biotransformação dos polifenóis podem atingir os tecidos. E, de fato, esses metabólitos são encontrados em concentrações mais altas do que seus “compostos originais” (43).
Juntos, esses achados demonstraram um efeito protetor eficiente da suplementação de MOF contra os efeitos adversos da síndrome metabólica induzida pela dieta de frutose e suas primeiras alterações metabólicas iniciais, como resistência à insulina e distúrbios cardiovasculares associados. Os presentes resultados também destacam os efeitos deletérios da frutose consumo no início da vida, o que pode levar a adultos com síndrome metabólica grave e comorbidades.
Pontos fortes e limitações do estudo
Embora existam diferentes modelos murinos para mimetizar a síndrome metabólica, a decisão sobre qual modelo usar para um determinado experimento é muitas vezes multifatorial. A vantagem deste modelo sobre os modelos genéticos é que nem toda a população é geneticamente afetada e pode desenvolver síndrome metabólica. Outro ponto importante é o tipo de açúcar utilizado na dieta. Decidimos usar frutose porque muitos estudos relataram que o consumo crônico está fortemente associado a uma variedade de doenças metabólicas relacionadas, incluindo obesidade, resistência sistêmica à insulina, síndrome metabólica e diabetes mellitus tipo 2.
Infelizmente, no mundo há um alto consumo de refrigerantes, que em sua maioria são adoçados com xarope rico em frutose (60% + 40% sacarose). Esta é uma das razões pelas quais decidimos usar este modelo de frutose.
Embora este estudo esteja focado em avaliar se a suplementação com MOF previne distúrbios metabólicos da frutose, uma das limitações deste trabalho é a falta de conhecimento do mecanismo pelo qual a suplementação com MOF pode modular o metabolismo para evitar os efeitos da dieta rica em frutose. Outra limitação do estudo está relacionada à falta de quantificação de açúcares na dieta. Nesse contexto, é importante mencionar que os dados aqui obtidos in vitro e in vivo são preliminares, sendo necessárias mais pesquisas para elucidar esses pontos.
Além disso, há uma falta de conhecimento sobre a farmacocinética dos compostos presentes na MOF para melhor compreensão da metabolização e entrega de metabólitos aos tecidos. Nesse contexto, mais análises são necessárias para elucidar esse ponto.
Conclusão
Em conjunto, os dados aqui apresentados mostram que a farinha de Moringa oleifera previne os distúrbios metabólicos iniciais induzidos pela ingestão de frutose. O estudo fitoquímico do MOF demonstrou uma série de compostos fenólicos, o que está correlacionado com a atividade antioxidante apresentada nos estudos in vitro. In vivo, o MOF preveniu a resistência à insulina, dislipidemia e hipertrofia de adipócitos. No entanto, mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos envolvidos.
Declaração de Contribuições dos Autores
Coleta de dados: ICBC, ICZ, IRS, MFB, ADF, MJG, EAS, LB e SG; análise estatística: ICBC, LB, JRS, RN, LV, NLMQ e IDM; análise e interpretação dos dados: JRS, NLMQ, IDM, AMOS e LV; redação do manuscrito: JRS, IDM e NLMQ; revisão crítica do manuscrito: JRS.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por bolsas do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, número: 429505/2018-3) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, cod. 001). I.C.B.T e M.F.B eram alunos de mestrado e bolsistas da CAPES (Cod. 001) durante o estudo. N.L.M.Q. e J.R.S. são pesquisadores do CNPq (processos números 305550/2018-7 e 310326/2020-6).
Conflito de interesses
Os autores declaram não haver relações financeiras e/ou pessoais que possam apresentar um potencial conflito de interesses.
Referências
1. Ma, X., Lin, L., Yue, J., Wu, C. S., Guo, C. A., Wang, R., Yu, K. J., Devaraj, S., Murano, P., Chen, Z., & Sun, Y. (2017). Suppression of Ghrelin Exacerbates HFCS-Induced Adiposity and Insulin Resistance. International Journal of Molecular Sciences, 18(6). https://doi.org/10.3390/IJMS18061302
2. Mortera, R. R., Bains, Y., & Gugliucci, A. (2019). Fructose at the crossroads of the metabolic syndrome and obesity epidemics. Frontiers in bioscience (Landmark edition), 24(2), 186–211. https://doi.org/10.2741/4713
3. Goss, M. J., Nunes, M. L. O., Machado, I. D., Merlin, L., Macedo, N. B., Silva, A. M. O., Bresolin, T. M. B., & Santin, J. R. (2018). Peel flour of Passiflora edulis Var. Flavicarpa supplementation prevents the insulin resistance and hepatic steatosis induced by low-fructose-diet in young rats. Biomedicine & Pharmacotherapy, 102, 848–854. https://doi.org/10.1016/J.BIOPHA.2018.03.137
4. Ogunsina, B. S., Radha, C., & Indrani, D. (2011). Quality characteristics of bread and cookies enriched with debittered Moringa oleifera seed flour. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 62(2), 185–194. https://doi.org/10.3109/09637486.2010.526928
5. Pari, L., & Kumar, N. A. (2004). Hepatoprotective Activity of Moringa oleifera on Antitubercular Drug-Induced Liver Damage in Rats. Https://Home.Liebertpub.Com/Jmf, 5(3), 171–177. https://doi.org/10.1089/10966200260398206
6. Gupta, R., Mathur, M., Bajaj, V. K., Katariya, P., Yadav, S., Kamal, R., & Gupta, R. S. (2012). Evaluation of antidiabetic and antioxidant activity of Moringa oleifera in experimental diabetes. Journal of Diabetes, 4(2), 164–171. https://doi.org/10.1111/J.1753-0407.2011.00173.X
7. López, M., Ríos-Silva, M., Huerta, M., Cárdenas, Y., Bricio-Barrios, J. A., Díaz-Reval, M. I., Urzúa, Z., Huerta-Trujillo, M., López-Quezada, K., & Trujillo, X. (2018). Effects of Moringa oleifera leaf powder on metabolic syndrome induced in male Wistar rats: a preliminary study. The Journal of International Medical Research, 46(8), 3327. https://doi.org/10.1177/0300060518781726
8. Ghasi, S., Nwobodo, E., & Ofili, J. O. (2000). Hypocholesterolemic effects of crude extract of leaf of Moringa oleifera Lam in high-fat diet fed wistar rats. Journal of Ethnopharmacology, 69(1), 21–25. https://doi.org/10.1016/S0378-8741(99)00106-3
9. Daba, M.-H., Elmasry, A., & El-Karef, A. A. (2015). Effect of moringa oleifera with and without metformin on an experimental model of metabolic syndrome in rats. International Journal of Advanced Research, 3(10), 1624–1632.
10. Othman, A. I., Amer, M. A., Basos, A. S., & El-Missiry, M. A. (2019). Moringa oleifera leaf extract ameliorated high-fat diet-induced obesity, oxidative stress and disrupted metabolic hormones. Clinical Phytoscience 2019 5:1, 5(1), 1–10. https://doi.org/10.1186/S40816-019-0140-0
11. Mehta, L. K., Balaraman, R., Amin, A. H., Bafna, P. A., & Gulati, O. D. (2003). Effect of fruits of Moringa oleifera on the lipid profile of normal and hypercholesterolaemic rabbits. Journal of Ethnopharmacology, 86(2–3), 191–195. https://doi.org/10.1016/S0378-8741(03)00075-8
12. Vongsak, B., Sithisarn, P., Mangmool, S., Thongpraditchote, S., Wongkrajang, Y., & Gritsanapan, W. (2013). Maximizing total phenolics, total flavonoids contents and antioxidant activity of Moringa oleifera leaf extract by the appropriate extraction method. Industrial Crops and Products, 44, 566–571. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2012.09.021
13. Oboh, G., Agunloye, O. M., Adefegha, S. A., Akinyemi, A. J., & Ademiluyi, A. O. (2015). Caffeic and chlorogenic acids inhibit key enzymes linked to type 2 diabetes (in vitro): A comparative study. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology, 26(2), 165–170. https://doi.org/10.1515/jbcpp-2013-0141/machinereadablecitation/ris
14. Sanchez, M. B., Miranda-Perez, E., Verjan, J. C. G., de los Angeles Fortis Barrera, M., Perez-Ramos, J., & Alarcon-Aguilar, F. J. (2017). Potential of the chlorogenic acid as multitarget agent: Insulin-secretagogue and PPAR α/γ dual agonist. Biomedicine & Pharmacotherapy = Biomedecine & Pharmacotherapie, 94, 169–175. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2017.07.086
15. Ahangarpour, A., Sayahi, M., & Sayahi, M. (2019). The antidiabetic and antioxidant properties of some phenolic phytochemicals: A review study. Diabetes & Metabolic Syndrome, 13(1), 854–857. https://doi.org/10.1016/j.dsx.2018.11.051
16. Scarminio, V., Fruet, A. C., Witaicenis, A., Rall, V. L. M., & di Stasi, L. C. (2012). Dietary intervention with green dwarf banana flour (Musa sp AAA) prevents intestinal inflammation in a trinitrobenzenesulfonic acid model of rat colitis. Nutrition Research (New York, N.Y.), 32(3), 202–209. https://doi.org/10.1016/j.nutres.2012.01.002
17. Irondi, E. A., Olalekan Agboola, S., Oboh, G., Boligon, A. A., Linde Athayde, M., & Shode, F. O. (2016). Guava leaves polyphenolics-rich extract inhibits vital enzymes implicated in gout and hypertension in vitro. J Intercult Ethnopharmacol •, 2. https://doi.org/10.5455/jice.20160321115402
18. Mamikutty, N., Thent, Z. C., Sapri, S. R., Sahruddin, N. N., Mohd Yusof, M. R., & Haji Suhaimi, F. (2014). The establishment of metabolic syndrome model by induction of fructose drinking water in male Wistar rats. BioMed Research International, 2014. https://doi.org/10.1155/2014/263897
19. Storlien, L. H., Higgins, J. A., Thomas, T. C., Brown, M. A., Wang, H. Q., Huang, X. F., & Else, P. L. (2000). Diet composition and insulin action in animal models. The British Journal of Nutrition, 83 Suppl 1(SUPPL. 1). https://doi.org/10.1017/s0007114500001008
20. Yuan, L., Wang, Y., Lu, C., & Li, X. (2013). Angiotensin-Converting Enzyme 2 Deficiency Aggravates Glucose Intolerance via Impairment of Islet Microvascular Density in Mice with High-Fat Diet. Journal of Diabetes Research, 2013. https://doi.org/10.1155/2013/405284
21. Galarraga, M., Campión, J., Munõz-Barrutia, A., Boqué, N., Moreno, H., Martínez, J. A., Milagro, F., & Ortiz-de-Solórzano, C. (2012). Adiposoft: automated software for the analysis of white adipose tissue cellularity in histological sections. Journal of Lipid Research, 53(12), 2791–2796. https://doi.org/10.1194/JLR.D023788
22. Folch, J., Lees, M., & Sloane Stanley, G. H. (1957). A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry, 226(1), 497–509. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)64849-5
23. Uchiyama, M., & Mihara, M. (1978). Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Analytical Biochemistry, 86(1), 271–278. https://doi.org/10.1016/0003-2697(78)90342-1
24. Joung, H., Kim, B., Park, H., Lee, K., Kim, H. H., Sim, H. C., Do, H. J., Hyun, C. K., & Do, M. S. (2017). Fermented Moringa oleifera Decreases Hepatic Adiposity and Ameliorates Glucose Intolerance in High-Fat Diet-Induced Obese Mice. Https://Home.Liebertpub.Com/Jmf, 20(5), 439–447. https://doi.org/10.1089/JMF.2016.3860
25. Omodanisi, E. I., Aboua, G. Y., & Oguntibeju, O. O. (2017). Therapeutic potentials and pharmacological properties of Moringa oleifera Lam in the treatment of diabetes mellitus and related complications. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 16(7), 1737–1746. https://doi.org/10.4314/tjpr.v16i7.35
26. Sultana, B., Anwar, F., & Ashraf, M. (2009). Effect of extraction solvent/technique on the antioxidant activity of selected medicinal plant extracts. Molecules (Basel, Switzerland), 14(6), 2167–2180. https://doi.org/10.3390/molecules14062167
27. Valdez-Solana, M. A., Mejía-García, V. Y., Téllez-Valencia, A., García-Arenas, G., Salas-Pacheco, J., Alba-Romero, J. J., & Sierra-Campos, E. (2015). Nutritional content and elemental and phytochemical analyses of moringa oleifera grown in Mexico. Journal of Chemistry, 2015. https://doi.org/10.1155/2015/860381
28. Ksouri, R., Ksouri, W. M., Jallali, I., Debez, A., Magné, C., Hiroko, I., & Abdelly, C. (2012). Medicinal halophytes: potent source of health promoting biomolecules with medical, nutraceutical and food applications. Critical reviews in biotechnology, 32(4), 289–326. https://doi.org/10.3109/07388551.2011.630647
29. Nimrouzi, M., Ruyvaran, M., Zamani, A., Nasiri, K., & Akbari, A. (2020). Oil and extract of safflower seed improve fructose induced metabolic syndrome through modulating the homeostasis of trace elements, TNF-α and fatty acids metabolism. Journal of Ethnopharmacology, 254. https://doi.org/10.1016/j.jep.2020.112721
30. Ramírez-Higuera, A., Peña-Montes, C., Herrera-Meza, S., Mendoza-López, R., Valerio-Alfaro, G., & Oliart-Ros, R. M. (2020). Preventive Action of Sterculic Oil on Metabolic Syndrome Development on a Fructose-Induced Rat Model. Journal of Medicinal Food, 23(3), 305–311.
31. Lin, W. T., Chan, T. F., Huang, H. L., Lee, C. Y., Tsai, S., Wu, P. W., Yang, Y. C., Wang, T. N., & Lee, C. H. (2016). Fructose-Rich Beverage Intake and Central Adiposity, Uric Acid, and Pediatric Insulin Resistance. The Journal of Pediatrics, 171, 90-96.e1. https://doi.org/10.1016/j.jpeds.2015.12.061
32. Metwally, F. M., Rashad, H. M., Ahmed, H. H., Mahmoud, A. A., Abdol Raouf, E. R., & Abdalla, A. M. (2017). Molecular mechanisms of the anti-obesity potential effect of Moringa oleifera in the experimental model. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 7(3), 214–221. https://doi.org/10.1016/j.apjtb.2016.12.007
33. Anitha Nandhini, A. T., Balakrishnan, S. D., & Anuradha, C. v. (2002). Taurine improves lipid profile in rats fed a high fructose-diet. Nutrition Research, 22(3), 343–354. https://doi.org/10.1016/S0271-5317(01)00391-8
34. Leavens, K. F., & Birnbaum, M. J. (2011). Insulin signaling to hepatic lipid metabolism in health and disease. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, 46(3), 200–215. https://doi.org/10.3109/10409238.2011.562481
35. Abd El Latif, A., el Bialy, B. E. S., Mahboub, H. D., & Abd Eldaim, M. A. (2014). Moringa oleifera leaf extract ameliorates alloxan-induced diabetes in rats by regeneration of β cells and reduction of pyruvate carboxylase expression. Biochemistry and Cell Biology. Biochimie et Biologie Cellulaire, 92(5), 413–419. https://doi.org/10.1139/bcb-2014-0081
36. Mohamed, M. A., Ahmed, M. A., & el Sayed, R. A. (2019). Molecular effects of Moringa leaf extract on insulin resistance and reproductive function in hyperinsulinemic male rats. Journal of Diabetes and Metabolic Disorders, 18(2), 487. https://doi.org/10.1007/s40200-019-00454-7
37. Ong, K. W., Hsu, A., & Tan, B. K. H. (2013). Anti-diabetic and anti-lipidemic effects of chlorogenic acid are mediated by ampk activation. Biochemical Pharmacology, 85(9), 1341–1351. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2013.02.008
38. Mock, K., Lateef, S., Benedito, V. A., & Tou, J. C. (2017). High-fructose corn syrup-55 consumption alters hepatic lipid metabolism and promotes triglyceride accumulation. The Journal of Nutritional Biochemistry, 39, 32–39. https://doi.org/10.1016/j.jnutbio.2016.09.010
39. Muhammad, N., Ibrahim, K. G., Ndhlala, A. R., & Erlwanger, K. H. (2020). Moringa oleifera Lam. prevents the development of high fructose diet-induced fatty liver. South African Journal of Botany, 129, 32–39. https://doi.org/10.1016/j.sajb.2018.12.003
40. Fabbrini, E., Magkos, F., Mohammed, B. S., Pietka, T., Abumrad, N. A., Patterson, B. W., Okunade, A., & Klein, S. (2009). Intrahepatic fat, not visceral fat, is linked with metabolic complications of obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(36), 15430–15435. https://doi.org/10.1073/pnas.0904944106
41. Janevski, M., Ratnayake, S., Siljanovski, S., McGlynn, M. A., Cameron-Smith, D., & Lewandowski, P. (2012). Fructose containing sugars modulate mRNA of lipogenic genes ACC and FAS and protein levels of transcription factors ChREBP and SREBP1c with no effect on body weight or liver fat. Food & Function, 3(2), 141–149. https://doi.org/10.1039/c1fo10111k
42. Takaki, A., Kawai, D., & Yamamoto, K. (2013). Multiple hits, including oxidative stress, as pathogenesis and treatment target in non-alcoholic steatohepatitis (NASH). International Journal of Molecular Sciences, 14(10), 20704–20728. https://doi.org/10.3390/IJMS141020704
43. Chen, X., Yin, O. Q., Zuo, Z., & Chow, M. S. (2005). Pharmacokinetics and modeling of quercetin and metabolites. Pharmaceutical research, 22(6), 892–901. https://doi.org/10.1007/s11095-005-4584-1
